Application de la métabolomique à la lithiase urinaire : la découverte et l'utilisation du succinate

Transduction de signal et thérapie ciblée volume 8, numéro d'article : 41 (2023) Citer cet article

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Les calculs urinaires sont conceptualisés comme un trouble métabolique chronique ponctué d'événements de calculs symptomatiques. Il a été démontré que la présence d'oxalate de calcium monohydraté (COM) lors de la formation des calculs est régulée par des modificateurs de croissance cristalline. Bien que les inhibiteurs de cristallisation soient reconnus comme une modalité thérapeutique depuis des décennies, des progrès limités ont été réalisés dans la découverte de modificateurs efficaces pour intervenir dans la maladie des calculs. Dans cette étude, nous avons utilisé des technologies métabolomiques, une approche puissante pour identifier des biomarqueurs en criblant les composants urinaires de la progression dynamique dans un modèle de calculs vésicaux. Grâce à l'exploration approfondie et à l'analyse des données métabolomiques, nous avons criblé cinq métabolites différentiels. Grâce à des études de théorie fonctionnelle de la densité et à la cristallisation en masse, nous avons découvert que trois d'entre eux (acide salicylurique, gentisique et succinate) pouvaient inhiber efficacement la nucléation in vitro. Nous avons ainsi évalué l'impact des inhibiteurs avec un modèle de rat induit par l'EG pour les calculs rénaux. Notamment, le succinate, un acteur clé du cycle de l'acide tricarboxylique, pourrait diminuer le dépôt de calcium rénal et les lésions dans le modèle. L'analyse transcriptomique a en outre montré que l'effet protecteur du succinate était principalement anti-inflammatoire, inhibant l'adhésion cellulaire et la différenciation ostéogénique. Ces résultats indiquent que le succinate peut fournir une nouvelle option thérapeutique pour les calculs urinaires.

La lithiase urinaire est un trouble urologique relativement typique dont la prévalence mondiale n'a cessé d'augmenter au cours des dernières décennies.1 C'est aussi une maladie avec un taux de rechute à 5 ans pouvant atteindre 50%.2 L'étiologie de la lithiase urinaire est complexe et peut être influencée par l'obésité, le diabète, l'hypertension et les syndromes métaboliques.3 Les calculs d'oxalate de calcium (CaOx) représentent plus de 75 % des calculs urinaires, suivis par les types d'acide urique, de phosphate de calcium, de struvite et de cystine.4 La lithiase urinaire est un processus en plusieurs étapes impliquant la nucléation, la croissance et l'agrégation des cristaux, bien que le mécanisme sous-jacent ne soit pas encore entièrement compris.5 Comment inhiber la lithiase urinaire et prédire son risque sous-jacent, restait un grand défi.6

L'hétérogénéité des types de calculs chez les patients crée une exigence pour une gestion personnalisée du traitement, qui peut inclure la régulation alimentaire/la consommation d'eau, l'administration de plusieurs types de médicaments approuvés par la FDA et une intervention chirurgicale pour retirer les calculs.7 De nos jours, les problèmes de récidive de lithiase urinaire et prévalence suscite toujours une grande attention socio-économique. Par conséquent, rechercher de nouveaux traitements est nécessaire.8

Parallèlement à la recherche de médicaments pour la prévention et le traitement des calculs, les modificateurs qui peuvent influencer la cristallisation ont attiré une attention accrue. complexe avec les ions libres dans l'urine.10 De nombreuses espèces naturelles et synthétiques peuvent inhiber sa croissance. Mais il est encore très difficile de faire le pont entre les preuves in vitro et in vivo. La combinaison d'études expérimentales, d'études animales et d'essais cliniques peut faciliter notre connaissance de la modification de la croissance cristalline et de sa fonction dans la cristallisation.5 À ce jour, seules deux molécules, à savoir l'acide polyacrylique et une molécule de phosphate d'inositol divalent, inhibent la cristallisation de CaOx en réduisant le dépôt rénal de CaOx.

La pathogenèse de la lithiase urinaire associée à de nombreux facteurs métaboliques et externes. Bien que le mécanisme ne soit pas encore entièrement compris, un fait est sans aucun doute qu'il est influencé par la composition de l'urine.4 L'urine est une sorte de mélange complexe d'espèces moléculaires abondantes comprenant à la fois des inhibiteurs et des promoteurs du développement des calculs rénaux.12 survenue chez les patients atteints de spina-bifida qui avaient souffert de calculs vésicaux après l'augmentation.13 Les troubles métaboliques sont étroitement liés aux calculs non infectieux. dont la moitié n'a pas été identifiée. L'urine contient environ 1823 protéines, dont 671 sont des constituants récemment identifiés.15

La métabonomique étudie principalement les petites substances moléculaires dans les cellules et les tissus. Ces substances sont étroitement liées à la santé du corps et sont principalement obtenues par le métabolisme de diverses substances dans des conditions physiologiques ou pathologiques. À l'heure actuelle, dans le domaine de la thérapie personnalisée, les substances à petites molécules commencent à recevoir une attention considérable et deviennent la pierre angulaire de la recherche sur les biomarqueurs.16,17 Dans le domaine de la recherche sur les reins, la métabonomique a été largement utilisée et a obtenu des résultats remarquables, et a également été utilisé pour étudier de nouveaux marqueurs pour le diagnostic des maladies rénales.18 Avec le développement rapide de la technologie de la bio-information, le champ d'application de la technologie métabonomique s'élargit également. Par exemple, il a été appliqué dans le domaine de la recherche sur les mécanismes de la maladie et de la sélection des cibles. En outre, les méthodes métabonomiques ont également une grande valeur d'application dans le domaine de la recherche sur les modèles animaux de pierre CaOx, à travers lesquels de nombreuses voies métaboliques anormales ont été identifiées. grande valeur pour le traitement de cette maladie.20

Nos études précédentes ont montré que les calculs se forment toujours dans la vessie du lapin au début (1 à 2 semaines) après l'augmentation de la vessie, et peuvent soit se résoudre, soit se développer avec le temps.21 était beaucoup plus grand que la circonférence de l'urètre du lapin, et il était difficile d'excréter le système autonome, jusqu'à ce qu'une étude récente sur les cristaux de CaOx ait trouvé une nouvelle voie d'inhibition qui peut conduire à la dissolution des calculs avec très peu de modificateurs.22 Pour identifier les nouveaux inhibiteurs de cristaux , nous avons analysé les échantillons d'urine du modèle de calculs vésicaux et du contrôle normal en utilisant la métabolomique non ciblée, dans le but d'identifier de nouvelles cibles d'intervention thérapeutique et de combler les découvertes in vitro et in vivo.

Nous avons utilisé le PC-SIS (procyanidines réticulées sous-muqueuse de l'intestin grêle) pour réparer les défauts de la vessie de pleine épaisseur dans un modèle de lapin pour les calculs vésicaux.21 L'examen échographique a révélé un fort écho et une ombre dans la lumière de la vessie de tous les animaux modèles après 2 semaines (Fig. 1b). Le calcul récolté pour visualiser la taille, la distribution et le composant. D'après les Fig. 1c, d, les calculs étaient de forme irrégulière avec une surface texturée beige, tandis que le résultat de l'échographie abdominale correspondait étroitement à l'aspect brut des calculs. Par spectre FTIR, qui peut fournir une caractérisation fiable et mettre en évidence la composition des calculs urinaires à l'échelle atomique (Fig. 1d), le CaOx et l'hydroxyapatite (HAP) sont des composants typiques des échantillons. Les bandes d'absorption à 1036 cm-1 sont dues à l'étirement HAP, alors que celle à 660 cm-1 peut correspondre aux vibrations COM. Les bandes diagnostiques de 1643 cm−1 (C = O vibration), et 780 cm−1 (CC stretching) sont caractéristiques du Calcium. Comme découvert, l'oxalate de calcium dihydraté (COD) a apporté une contribution significative à l'échantillon.23 Par analyse d'urine biochimique (Fig. 1e, f), le taux de calcium a augmenté de manière significative 2 semaines après la chirurgie. En revanche, la concentration de calcium sanguin ne différait pas entre l'animal modèle et les témoins normaux.

Les changements dynamiques de la pierre et l'analyse des composants. a, b Images représentatives de la vessie par échographie abdominale de contrôle normal et modèle de calculs vésicaux à 2 et 4 semaines. c Vue macroscopique et échographie abdominale de l'échantillon de pierre du même individu. d Spectres infrarouges et morphologie grossière de la pierre. e, f Quantification du taux de calcium dans les échantillons d'urine et de sang. *P < 0,05 par rapport au groupe témoin. Pour (e–f), n = 10 lapins dans chaque groupe

Notamment, jusqu'à 70 % des calculs ont disparu en 4 semaines (Fig. 1b). La taille de l'urètre des lapins adultes varie de 4 à 10 mm sous différentes pressions urétrales, ce qui est bien inférieur à la taille de la pierre, il est difficile d'être excrété spontanément (tableau supplémentaire 1).24 La formation de calculs urinaires subit de multiples processus qui contient la nucléation, la formation et l'agrégation des cristaux, cette dernière étant régulée par des inhibiteurs et des promoteurs de cristaux.25 L'analyse microscopique a montré que la dissolution s'est principalement produite pendant le processus minérogénétique des calculs rénaux.26 Cela contredit le concept largement répandu selon lequel les calculs ne peut pas se dissoudre,27,28 et a ouvert un nouveau paradigme pour les approches cliniques, où la dissolution ciblée in vivo peut atténuer l'influence néfaste de la maladie des calculs. Pendant ce temps, cela nous a également amenés à réfléchir si les changements dynamiques du tartre peuvent être attribués à la présence de modificateurs de cristaux dans l'urine. En tant que mélange complexe de métabolites, l'urine contient environ 3100 petites molécules avec certains modificateurs actifs (inhibiteurs de cristaux ainsi que promoteurs).29 En tant que tel, il est difficile d'identifier les inhibiteurs qui peuvent influencer le développement de calculs pathologiques.

La présence probable de modificateurs de cristaux suggère que certaines compositions urinaires naturelles, y compris les métabolites, peuvent affecter la croissance des cristaux et la formation de calculs. échantillons de témoins normaux (10 échantillons) et de modèles de calculs vésicaux (10 échantillons) à différents moments (1, 2, 3 et 4 semaines après la chirurgie d'augmentation de la vessie) (Fig. 2a). À partir de la Fig. 2b, les métabolites négatifs ont été clairement séparés entre les groupes témoins normaux et traités par chirurgie sur la base de l'analyse des coordonnées principales (PCoA). À cette fin, nous nous sommes concentrés sur les métabolites négatifs et avons quantifié la ségrégation entre le contrôle et le modèle à différents moments après la chirurgie par analyse PLS-DA, et avons découvert une différence évidente entre les deux profils (Fig. 1 supplémentaire). L'analyse des voies par paires (Fig. 1 supplémentaire) et les comparaisons de groupes multiples (Fig. 2c) ont identifié les transporteurs ABC, la dégradation de la lysine, le métabolisme de la phénylalanine et la voie du métabolisme de la tyrosine comme enrichissement significatif dans le KEGG. Pour délimiter davantage les métabolites impliqués dans les voies enrichies, nous avons tracé les cartes thermiques des groupes témoins et modèles pour les quatre voies (Fig. 2d et Fig. 1 supplémentaire) afin de révéler la différence de métabolites entre les deux groupes.

Le profilage métabolomique a identifié cinq molécules organiques comme candidates pour les inhibiteurs de cristaux. un schéma représentant la conception des expériences de profilage métabolomique. b Analyse des coordonnées principales (PCoA) pour les ions positifs et négatifs de l'animal témoin et modèle sur la base des profils de métabolites des échantillons d'urine. c Analyse d'enrichissement de la voie KEGG des groupes témoins et modèles. d Carte thermique des transporteurs ABC, dégradation de la lysine, métabolisme de la phénylalanine et voie métabolique de la tyrosine. e Altération des cinq molécules organiques sur la base des profils de métabolites et de l'analyse statistique, *P < 0,05 par rapport au groupe témoin. Pour (a–e), n = 10 lapins dans chaque groupe

Les composés organiques polyprotiques et les cristaux peuvent interagir par électrostatique dans le système de minéralisation du calcium, où le critère de sélection d'un inhibiteur efficace est une molécule possédant plusieurs groupes chargés.30 En fait, certains des inhibiteurs les plus efficaces pour les cristaux de calcium avaient du carboxylate (–COOH), des groupes fonctionnels hydroxyle (–OH) et/ou sulfate (–OSO3–) qui peuvent interagir avec la surface cristalline dans l'urine.31,32 Nous avons donc sélectionné cinq molécules avec des groupes fonctionnels basés sur l'analyse des cartes thermiques, qui comprenaient la taurine Acide subérique (–COOH), succinate (–COOH), acide salicylurique (–COOH, –OH) et acide gentisique (–COOH, –OH) à partir des métabolites exprimés de manière différentielle pour une analyse plus approfondie (Fig. 2e). L'analyse statistique a montré que le changement du niveau d'acide organique n'a révélé aucune régularité évidente, suggérant qu'ils ont joué divers rôles dans la modification des cristaux.

La théorie fonctionnelle de la densité (DFT) a été utilisée pour faire la lumière sur l'action des modificateurs. L'énergie d'adsorption du modificateur sur la surface COM (100) était acide gentisique > salicylurique > acide succinique > acide subérique > taurine. Les énergies de liaison des modificateurs sur la surface COM (021) étaient conformes à celles de la surface COM (100) à l'exception des acides salicylurique et subérique (tableau supplémentaire 2). Par rapport à d'autres modificateurs, la force de liaison entre l'acide gentisique avec la surface COM (100) et (021) (Fig. 3b, c) était supérieure. Pour quantifier la force des modificateurs liés aux surfaces COM (100) et (021), nous avons calculé le déplacement moyen δ des atomes (tableau supplémentaire 3). Le résultat a révélé que l'adsorption de tous les modificateurs sur la surface (100) a entraîné une déformation plus élevée par rapport à la surface (021). La liaison de l'acide gentisique avec la surface COM a conduit à la déformation la plus élevée (100 δ = 0,418 Å ; 021 δ = 0,206 Å). En revanche, la taurine a la plus faible contrainte (100 δ = 0,211 Å ; 021 δ = 0,099 Å). Il a été précédemment démontré que sous une contrainte de traction constante, la déformation du cristal pouvait réduire son taux de croissance. Cela suggère également que l'effet de l'acide gentisique sur la prévention de la croissance des cristaux est meilleur que celui de la taurine.22,33

Énergie de liaison des modificateurs sur la surface COM et Ca2+. a Les structures optimisées des acides COM, taurine, subérique, succinique, salicylurique et gentisique. b, c Structures optimisées des molécules sur la surface COM (100) et COM (021), avec les boules rose clair, bleu clair, marron, bleu, jaune et rouge désignant les H, Ca, C, N, S et les atomes O, respectivement. d Spectres photoélectroniques aux rayons X (XPS) de la taurine, de l'acide subérique, des acides succinique, salicylurique et gentisique adsorbés au Ca2+. Les pics ajustés en bleu, rose et rouge correspondent aux pics C1s de C = O, C–O et C–C, respectivement

En plus des interactions de surface COM, cette étude a également analysé la coordination des modificateurs avec Ca2+ (Fig. 2a supplémentaire, Tableau supplémentaire 4). Les calculs ont indiqué que l'acide gentisique, le salicylurique et le succinate présentaient une plus grande affinité pour le complexe d'ions Ca2+ par rapport à l'acide subérique et à la taurine. La liaison de l'acide gentisique avec Ca2+ était la plus énergique. Les types d'interaction des modificateurs et du Ca2+ ont été détectés sur la base de la spectroscopie XPS (Fig. 3d, Fig. 2b supplémentaire et Tableau 5). L'énergie de liaison dans la spectroscopie XPS repose sur un minuscule déplacement chimique causé par les charges atomiques. Par conséquent, il est associé à la charge atomique nette.34 Nous nous sommes concentrés sur les changements dans les pics de calcium d'acide organique et d'acide organique C1s avec C = O qui peuvent interagir avec Ca2+. La plage de changement du C = O de l'acide organique et du calcium de l'acide organique reflétait la taille de l'énergie de liaison et la tendance de changement comme suit : acide gentisique > salicylurique > succinate > acide subérique > taurine avec la même tendance que les calculs DFT. Compte tenu de la diversité des effets inhibiteurs des modificateurs, nous devons en outre démontrer l'effet inhibiteur des modificateurs par des expériences in vitro et in vivo.

Avec ou sans modificateurs, la cristallisation en vrac est détectée au microscope pour déterminer les changements correspondants dans la taille et la morphologie des cristaux. Cette technologie n'a pas besoin de mener une opération d'invasion lors de l'analyse de la cristallisation, afin d'analyser l'effet du modificateur de manière plus efficace et plus précise. En micrographie optique, la taurine et l'acide subérique n'ont montré aucun effet apparent sur la morphologie et la surface des cristaux par rapport au témoin. En revanche, le succinate, l'acide salicyrique et l'acide gentisique ont généré des cristaux classiques de forme tétragonale (Fig. 4a, b). Cela a reflété l'inhibition du taux de croissance des cristaux et la suppression sous-jacente de la nucléation COM (Fig. 4b, 4c). Le mécanisme classique de la croissance cristalline comprenait la nucléation en couches 2D et l'étape avancée à travers les plans cristallins. La présence d'inhibiteurs à la surface du cristal peut entraver la formation et la croissance des cristaux.35 La microscopie à force atomique (AFM) de la topologie de la surface du cristal (Fig. 4e) a montré que les cristaux de contrôle et de taurine avaient les plus petits changements de profondeur (dans les 3 nm), bien qu'il y ait des défauts sur la surface du cristal. Suite à l'intervention avec de l'acide gentisique et du succinate, une croissance cristalline évidente peut être observée. Le défaut de surface des cristaux traités à l'acide gentisique était le plus important, avec une plage d'environ 8 nm. Des fissures régulières profondes (profondeur : 5 nm) peuvent être observées dans les cristaux de succinate au cours des étapes de croissance, ce qui peut être attribué au fait que les inhibiteurs de cristaux ont modifié la direction de la croissance des cristaux et ont en outre entraîné une diminution de la stabilité de la structure cristalline.

Inhibition de la nucléation COM in vitro. a Micrographies optiques (barre d'échelle : 20 μm) et SEM (barre d'échelle : 2 μm et 4 μm). b–d Analyse semi-quantitative de la surface cristallisée et du nombre et ratio de COM et DCO (COM-CaOx monohydraté, DCO-CaOx dihydraté, nd-non défini), *P < 0,05 par rapport au groupe témoin. e Images AFM de (001) croissance de surface et inhibition avec ou sans le modificateur (barre d'échelle : 400 nm). f Spectres FTIR avec ou sans le modificateur

Les études précédentes ont principalement porté sur l'influence des inhibiteurs sur la cristallisation de COM, notre analyse s'est principalement concentrée sur l'induction de COM et de COD. Pour évaluer ce dernier, nous avons mesuré le ratio de COM. Comme le montre la figure 4d, la taurine et l'acide subérique ont tous deux favorisé de manière significative la nucléation de la COM (52 % ± 5 % et 49 % ± 15 %, respectivement) par rapport au contrôle normal (36 % ± 8 %). Le succinate, l'acide salicyrique et l'acide gentisique ont tous conduit à <30 % de nucléation COM et >37 % de nucléation COD par rapport au témoin normal (13 % ± 2 %), ce qui a confirmé leur effet inhibiteur sur la nucléation COM. Les expériences FTIR (Fig. 4f) ont également révélé un passage d'une cristallisation majoritairement COM à majoritairement DCO avec du succinate, de l'acide salicyrique et de l'acide gentisique dans le système de cristallisation en masse. Le pic d'absorption à 660 cm-1 dans la région de l'empreinte digitale indiquait que la majeure partie de la phase cristalline était COM. De plus, 914 et 780 cm-1 étaient des pics d'absorption de COD. Les spectres FTIR des groupes de taurine étaient similaires, les pics d'absorption caractéristiques à 660 cm-1 indiquant que la majeure partie de la phase cristalline du cristal CaOx était COM. Après l'ajout d'acide salicylurique, d'acide subérique, d'acide gentisique et de succinate, les pics d'absorption de la solution cristalline sont passés de 1617 et 1322 cm−1 à 1643 et 1330 cm−1, ce qui indique que l'ajout de modificateurs a entraîné une augmentation de la DCO, ce qui était cohérent avec la caractérisation de la morphologie cristalline.36 Les cristaux de CaOx ont deux formes communes : COM et COD. La COD est moins liée à l'instabilité, et tandis que la COM est plus facilement attachée aux cellules épithéliales rénales et peut s'agréger pour former des calculs.37 Ainsi, une méthode pour supprimer la formation de calculs peut consister à cribler des modificateurs qui peuvent cibler la cristallisation de CaOx ainsi qu'induire la formation de DCO. Par rapport au témoin, l'instabilité accrue des cristaux de DCO avec l'ajout de succinate, d'acide salicylurique et d'acide gentisique a suggéré un rôle potentiel dans le traitement des calculs rénaux.

Nous avons sélectionné des modificateurs avec inhibition cristalline in vitro (acide salicylurique, gentisique et succinate) pour évaluer si les composés organiques polyprotiques ont un impact sur la formation de cristaux induite par l'EG. L'acide citrique, le composant principal du médicament d'intervention en pierre Ulaite, a été appliqué en tant que groupe d'intervention. Des rats Sprague-Dawley ont été traités avec des inhibiteurs (200 mg/kg) ou du NaCl à 0,9 % par gavage quotidien. Entre-temps, les rats du groupe expérimental et du groupe modèle ont accepté une solution d'EG à 1 % pour induire la formation de cristaux. Quatre semaines plus tard, l'apparence générale (Fig. 5a) et le poids (Fig. 5c) des reins des rats, ainsi que le poids corporel (Fig. 5b) ont été analysés pour évaluer l'état de base des rats. L'acide citrique et le succinate ont tous deux montré un effet protecteur pour le modèle de rat induit par l'EG, le groupe d'intervention succinate avait une apparence, un poids et un poids corporel similaires à ceux du contrôle normal, tandis que l'acide salicylurique et l'acide gentisique n'ont montré aucun effet significatif pour la protection rénale. . Alors que les modèles de rats induits par l'EG traités au NaCl, à l'acide salicylurique et à l'acide gentisique ont développé des calculs en 4 semaines, ceux traités avec de l'acide citrique et du succinate ont montré une inhibition significative de la formation de calculs, ainsi qu'un taux inférieur de BUN sanguin et de créatinine plasmatique (Fig. 5d – h ).

Le succinate a réduit le dépôt de cristaux rénaux et les lésions dans le modèle de cristallisation de CaOx de rat traité à l'EG. a Aspect grossier des reins. b, c Poids corporel et des reins, *P < 0,05 par rapport au groupe témoin ; # P < 0,05 par rapport au groupe modèle. d Imagerie micro-CT, e, f Des sections de rein de rat ont été colorées pour le dépôt de cristaux par coloration de Von Kossa (barre d'échelle : 400 μm), et les zones sombres du cristal ont été quantifiées, # P < 0,05 par rapport au groupe modèle. g, h Azote sanguin plasmatique (BUN) et créatinine (CREA), *P < 0,05 par rapport au groupe témoin ; # P < 0,05 par rapport au groupe modèle

Nous avons en outre évalué l'influence des modificateurs sur les fonctions rénales dans divers groupes de rats. Par coloration de Von Kossa (Fig. 5e, f, Fig. 3 supplémentaire), il y avait d'abondants cristaux de cristaux dans la zone frontalière entre le cortex et la moelle chez les rats traités à l'EG. Comparé à l'acide citrique, l'acide salicylurique et l'acide gentisique, le dépôt de cristaux de CaOx était évidemment plus faible dans le groupe succinate après le traitement EG (P < 0,05). Les lésions rénales ont été détectées par coloration à l'acide périodique-Schiff (PAS) et notées pour les lésions tubulaires (Fig. 4a, 4b supplémentaires). Comme prévu, les lésions rénales ont été significativement réduites avec 4 semaines de régime enrichi en succinate par rapport aux rats traités à l'EG. Notamment, le niveau de lésions rénales a été encore réduit par le traitement au succinate par rapport au groupe à l'acide citrique, suggérant un plus grand efflux d'oxalate des tissus rénaux, ce qui correspondait à une lésion plus légère des reins. Par immunohistochimie (IHC), les intensités de CD44, IL-6 et OPN (Fig. 5 supplémentaire) ont été régulées à la hausse dans les tubules du groupe traité par EG par rapport au groupe témoin. L'administration de succinate a significativement inhibé l'expression de CD44, IL-6, ce qui était conforme au résultat de l'analyse histologique et fonctionnelle.

L'impact global du succinate sur la reprogrammation du transcriptome du modèle de rat pendant la formation des cristaux a été mesuré sur la base de l'ARN-seq des tissus rénaux collectés 4 semaines après le traitement EG. L'analyse des voies et les résultats de la Q-PCR ont suggéré que, alors que les gènes exprimés de manière différentielle (DEG) dans le groupe succinate étaient significativement enrichis pour le métabolisme des acides aminés (Fig. 6a, c, Fig. 7 supplémentaire), tandis que ceux du groupe succinate étaient significativement enrichis pour réponse immunitaire et molécules d'adhésion cellule-cellule (Fig. 6b, c, Fig. 7 supplémentaire) par rapport au modèle traité par EG, qui a exercé un effet protecteur sur la lésion rénale. Par analyse ARN-seq, le groupe traité par EG a montré un enrichissement similaire pour les voies pro-inflammatoires, les molécules d'adhésion et les cellules de différenciation des ostéoclastes, etc. dans le rein modèle par rapport aux témoins (Fig. 6a supplémentaire), mais dans la direction opposée en termes de voie métabolique des acides aminés (Fig. 6b supplémentaire).

Inversion des lésions rénales induites par l'EG par le succinate, comme illustré par le séquençage de l'ARN. a, b Analyse d'enrichissement des termes de l'ontologie génique (GO) des processus biologiques influencés par le succinate et le traitement EG basé sur l'ensemble de données ARN-seq. Processus régulés à la hausse (à gauche) et à la baisse (à droite) dans le groupe traité au succinate par rapport au groupe modèle traité à l'EG. c Diagramme de points montrant la comparaison par paires des voies GSEA de l'ensemble de données ARN-seq du groupe modèle traité au succinate et à l'EG et des témoins correspondants. Les points bleus et rouges représentaient respectivement les voies régulées à la baisse et à la hausse. d Un nuage de points montrant le changement d'expression des DEG entre le groupe modèle traité par EG et le groupe succinate sur la base de l'ensemble de données RNA-seq. e Cartes thermiques montrant l'expression de gènes associés à des événements inflammatoires, apoptotiques et de survie dans les tissus rénaux de rat des groupes traités à l'EG et au succinate sur la base d'une analyse ARN-seq. Pour (a–e), n = 3 rats dans chaque groupe

En outre, la fonction d'amélioration du succinate sur les lésions rénales, y compris la réponse inflammatoire, les molécules d'adhésion et la différenciation des ostéoclastes après le traitement par EG, a été largement inversée. Cela a été vérifié par une analyse de carte thermique liée au transcriptome dans laquelle les changements de niveau de gène dans le groupe modèle ont été largement inversés par le succinate. Comme indiqué, les gènes participant au métabolisme des acides aminés étaient principalement enrichis en groupe succinate. En revanche, le modèle traité par EG a montré une forte corrélation avec la lésion rénale (c'est-à-dire l'induction de gènes), avec un enrichissement des gènes associés aux dommages cellulaires (Fig. 6d, e). Les diagrammes de dispersion et l'analyse des cartes thermiques ont suggéré que, parmi les DEG, ceux des groupes témoins étaient évidemment enrichis pour le métabolisme cellulaire des acides aminés, tandis que ceux régulés à la baisse dans les reins du groupe modèle étaient évidemment enrichis pour les molécules d'adhésion et la différenciation des ostéoclastes par rapport au groupe traité par EG. (Figures supplémentaires 6d, e).

Les principaux événements dans le développement des calculs urinaires comprennent la nucléation cristalline, la croissance cristalline et l'adhésion cristalline.38 En ciblant les sites d'interaction sur la surface cristalline, les inhibiteurs de cristallisation peuvent fournir une approche alternative pour réduire le taux de croissance cristalline. Cependant, jusqu'à présent, il n'y a eu aucun traitement pour la cristallisation de CaOx qui pourrait être utilisé pour le traitement de la maladie des calculs urinaires. pierre) à la pierre (calcul rénal). Parmi ceux-ci, l'acide succinique, l'acide salicylurique et l'acide gentisique ont montré l'effet d'inhibition des cristaux in vitro. Il convient de noter que lorsque l'acide citrique a été utilisé comme contrôle pour le traitement des calculs rénaux de rat induits par l'EG, l'acide succinique a montré une excellente inhibition du dépôt rénal de calcium en plus d'un effet protecteur. L'analyse transcriptomique a en outre montré que l'effet protecteur du succinate était principalement anti-inflammatoire, inhibant l'adhésion cellulaire et l'ostéogenèse et régulant le métabolisme des acides aminés.

Divers modificateurs de la croissance cristalline, le plus souvent des inhibiteurs, ont été développés récemment, allant des petites molécules et peptides aux protéines. Les molécules avec des groupes fonctionnels carboxylates et phosphates ont exercé une fonction de prévention significative sur la croissance cristalline de COM.38,40 Sur la base de ces critères et d'un dépistage rigoureux, une analyse approfondie des données métabolomiques non ciblées a montré que la taurine, l'acide subérique, succinique, salicylurique l'acide et l'acide gentisique avec des groupes sulfate et carboxylate peuvent interagir avec la surface du cristal pour affecter sa croissance. Comparer l'efficacité in vitro des inhibiteurs de cristallisation CaOx est un défi pour la différence des méthodes et des paramètres de test. Dans cette étude, nous avons combiné le calcul théorique DFT et les tests de cristallisation en vrac COM pour évaluer de manière exhaustive l'effet inhibiteur de chaque modificateur. Basé sur le mécanisme selon lequel la coloration de la surface cristalline a été imposée par l'adsorption de l'inhibiteur. ) indiquant que les interactions cristallines sont plus énergétiques que la taurine et l'acide subérique. Nous avons en outre calculé la capacité de liaison de chaque molécule au Ca2+, ce qui était conforme à la tendance des résultats XPS. La force de la capacité de liaison des petites molécules au Ca2+ dépendait principalement de l'électronégativité de l'oxygène dans le C = O. Plus l'électronégativité est forte, plus l'énergie de liaison au Ca2+ est forte. Les résultats du test de cristallisation ont indiqué que l'acide succinique, l'acide salicylurique et l'acide gentisique pouvaient réduire la taille et le nombre des cristaux, ce qui était cohérent avec les études précédentes sur l'inhibiteur de la cristallisation COM.43,44 Pendant la cristallisation, l'acide succinique, l'acide salicylurique et l'acide gentisique déplacer la COM vers la cristallisation de la DCO, ce qui peut conférer un effet thérapeutique car la DCO a une affinité plus faible pour les molécules de la membrane cellulaire épithéliale et peut ainsi réduire la rétention intratubulaire.11,45,46

Pour explorer l'effet de l'inhibiteur de cristaux sur les calculs rénaux in vivo, nous avons construit un modèle de rat induit par l'EG, où l'EG a été utilisé pour induire un dépôt excessif d'oxalate dans les tubules rénaux. L'oxalate précipité dans les tubules rénaux est le principal facteur de risque de formation de calculs rénaux de CaOx.47 Des inhibiteurs de cristaux et du citrate ont été appliqués aux modèles de rats pour évaluer leur effet sur les calculs rénaux. Parmi ceux-ci, le citrate est une sorte d'inhibiteur bien connu pour inhiber la génération de calculs rénaux en se combinant avec des ions Ca2+, conduisant à moins de calcium libre pour se lier à l'oxalate.48,49 Les changements de morphologie rénale chez les rats induits par l'EG ont été améliorés par l'application de succinate. Nous avons constaté que le succinate inversait considérablement le dépôt de CaOx induit par l'EG et réduisait les lésions et l'apoptose des cellules tubulaires. Les effets cytoprotecteurs du succinate ont été confirmés in vivo par une diminution des taux de créatinine sérique. Le mécanisme de protection du succinate sur le dépôt et les lésions rénales de CaOx a été étudié plus en détail par RNAseq. Une régulation frappante de l'inflammation, de l'adhésion cellulaire et de l'ostéogenèse a été causée par l'EG induite par le rein. L'anti-inflammatoire et l'ostéogenèse, le succinate ont presque complètement empêché le changement des niveaux de gènes ainsi que la régulation à la hausse des gènes liés au métabolisme des acides aminés. Le succinate a régulé à la baisse les niveaux d'expression des gènes liés à l'ostéogenèse, y compris l'IL-1, l'IL-6 et l'OPN, qui sont très étroitement liés aux lésions rénales et au dépôt de CaOx in vivo.50,51 La diminution de l'adhérence des cristaux de CaOx en régulant à la baisse l'expression les niveaux de CD68 et de CD44 peuvent fournir une nouvelle voie pour inhiber le dépôt de CaOx dans les reins.52 Les résultats justifient une étude plus approfondie de l'effet protecteur du succinate sur les calculs rénaux et la modulation.53

Dans cette étude, nous avons identifié un nouveau cristal inhibiteur succinate avec une efficacité exceptionnelle, et montré son effet in vivo sur le dépôt de CaOx. Le succinate est prometteur en tant que traitement efficace pour prévenir les calculs rénaux. Jusqu'à présent, seule une étude pilote sur un modèle de calculs rénaux chez le rat a été menée, visant à vérifier l'effet inhibiteur sur les dépôts et les lésions rénales de CaOx. Cependant, l'effet de la succinique sur les autres organes urinaires, en particulier la vessie, reste à vérifier. Dans le même temps, il sera intéressant (et important) de confirmer si l'administration de succinate peut également supprimer la progression des calculs rénaux et modifier la métabolomique du sang périphérique et de l'urine dans d'autres modèles animaux. Dans l'étude de suivi, une meilleure compréhension des voies métaboliques du succinate chez l'homme, du schéma posologique optimal et de la tolérabilité sont nécessaires avant les essais cliniques prospectifs du succinate dans ce domaine. Nous sommes également très intéressés par les cibles en aval du succinate, qui méritent d'être explorées et peuvent fournir une voie pour faire avancer sa traduction clinique.

Chlorure de calcium (CaCl2, 97 %), oxalate de sodium (Na2C2O4, 99,5 %), acide citrique (C6H8O7, 99 %), COM (CaC2O4·H2O), salicylurique (C7H6O3, 99 %), succinate (C4H6O4, 99 %), l'acide gentisique (C9H9NO5, 98%), la taurine (C2H7NO3S, 99%), l'acide subérique (C8H12O4, 99%), le chlorure de sodium (NaCl, AR) et l'EG (C2H6O2, 99,8%) ont été achetés chez Sigma Aldrich.

Toutes les expériences ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université du Sichuan (numéro d'enregistrement 2018190 A). Vingt lapins blancs mâles de Nouvelle-Zélande (2,5 ± 0,5 kg chacun) ont été répartis au hasard dans les groupes témoins normaux et modèles de calculs vésicaux. Après une période de quarantaine de 2 semaines, les animaux expérimentaux ont été mis à jeun pendant 12 h avant la chirurgie. Par la suite, ils ont été anesthésiés par une injection de pentobarbital sodique (2 mL/kg). Une incision de taille appropriée a été faite dans le bas de l'abdomen pour exposer la vessie. Ensuite, la paroi vésicale partielle de pleine épaisseur a été retirée et le modèle de défaut de paroi postérieure requis a été établi. Après stérilisation, 1 mg/mL PC-SIS a été entièrement suturé avec du fil soluble (5-0, Johnson, USA) 22 pour obtenir quatre lignes de suture (5-0 Monocryl) sans différence évidente, de manière à marquer les défauts du dos mur et fournir un support pour l'analyse ultérieure. Le muscle et la peau ont été suturés. Après l'opération, tous les animaux de laboratoire ont été remis dans la cage et nourris librement. La pénicilline a été injectée par voie intramusculaire pendant trois jours consécutifs. À différents moments (1, 2, 3 et 4 semaines), l'urine de lapin a été récoltée par une cage métabolique de lapin pour une analyse métabolomique non ciblée. Des échantillons d'urine ont été recueillis dans des tubes EP de 1,5 mL et centrifugés à grande vitesse pendant une demi-heure à 4 °C. Les échantillons ont été conservés dans un environnement à -80 ° C. De plus, des échantillons d'urine et de sang ont été prélevés pour l'analyse du calcium urinaire et sanguin.

Le calcul vésical a été détecté par échographie à 2 et 4 semaines. Et la solution saline stérile chaude a été injectée dans la vessie jusqu'à ce que la distension maximale soit atteinte. L'échographie a été réalisée avec un système à ultrasons (Philips, Best, Pays-Bas). Les échantillons ont été collectés, broyés et détectés avec un système d'analyse de pierre amélioré (Lanmode LIR-20) avec une plage de longueurs d'onde de 500 à 4000 cm-1 basée sur la méthode de pressage de pastilles KBr.

Pour l'analyse métabolomique non ciblée, une aliquote de 1 ml d'échantillon d'urine de lapin a été mélangée à 1 ml d'une solution d'acétonitrile/méthanol/eau (2:2:1, v/v), mélangée au vortex, soniquée pendant 30 min, repos à -20 °C pendant 1 h, puis centrifugé à grande vitesse pendant une demi-heure à 4 °C. Puis séché sous vide. Pour la spectrométrie de masse, l'échantillon séché a été additionné de 100 μL d'acétonitrile (1: 1, v / v) pour résoudre et centrifugé à 15 000 × g pendant 20 min à 4 ° C.

La métabolomique non ciblée a été dérivée en utilisant un système de chromatographie liquide à ultrahaute propriété (UHPLC; Infinity LC; CA, États-Unis) assorti d'un spectromètre de masse (TOF 6600; AB Sciex, Concord, Canada). Les métabolites urinaires ont été séparés dans des conditions optimisées à 4 °C avec une dose de 2 μL. Le débit était de 0,3 mL/min, le programme de séparation chromatographique : 0-1 min, 85 % B ; 1–12 min, 85–65 % B ; 12–12,1 min, 65–40 % B ; 12,1 à 15 min, 40 % de B ; 15–15,1 min, 40–85 % B ; 15,1–20 min, 8 % B (A, acétate d'ammonium 25 mM et hydroxyde d'ammonium dans l'eau ; B, acétonitrile). Lors de l'analyse UHPLC-MS, la température de contrôle est de 4 °C. Au cours de l'analyse par spectrométrie de masse, la source ESI a été sélectionnée et différents modes de détection ont été effectués à la température de la source de 600 ° C.

Une fois les données d'origine déterminées, l'outil ProteoWizard est utilisé pour les convertir afin d'obtenir des données dans le fichier. format mzML. Ensuite, le XCMS est utilisé pour effectuer des opérations d'alignement et de correction de pic, et les informations relatives à la zone de pic sont extraites. Pour l'extrait XCMS, supprimez le pic d'ion correspondant lorsqu'il est jugé que la valeur manquante est > 50 %. Dans la reconnaissance des formes, le logiciel SIMCA-P 14.1 est appliqué et la méthode de mise à l'échelle de Pareto est utilisée pour prétraiter les données, puis une analyse statistique est effectuée, comprenant principalement l'analyse PCA et PLS-DA. La méthode PLS-DA est principalement utilisée pour déterminer la qualité R2 et Q2, ainsi que l'importance variable (VIP). Le VIP décrit principalement les modifications des réactions de stimulation pathologiques expliquées par des métabolites spécifiques. Lors du jugement du métabolite avec une différence significative, les critères de jugement définis ont été définis comme VIP > 1 et P < 0,05. Les métabolites différentiellement exprimés ont été normalisés pour obtenir des grappes avec des modèles d'expression similaires. La carte thermique a été dérivée en regroupant les métabolites exprimés de manière différentielle sur la base du logiciel R. L'analyse KEGG a été réalisée sur test hypergéométrique, les voies avec P < 0,05 ont été considérées comme significatives.

CaCl2 et Na2C2O4 ont été respectivement dissous dans de l'eau déminéralisée pour former une solution mère de 10 mM. La cristallisation en masse du système de réaction de 10 ml a été réalisée dans des flacons en verre propres. Tout d'abord, une solution aqueuse de NaCl 150 mM a été ajoutée au flacon, puis une solution de CaCl2 de 0,7 ml a été ajoutée tout en mélangeant uniformément. Par la suite, les flacons en verre ont été placés dans un incubateur à 60 ° C pendant 1 h avant de déposer 0, 7 ml de solution mère de Na2C2O4. Des inhibiteurs de cristaux, par exemple la taurine, l'acide subérique, le succinate, l'acide salicylurique et l'acide gentisique, ont été ajoutés au système réactionnel en quantité appropriée avant l'addition de Na2C2O4 et la solution finale contient 1,5 mM d'inhibiteur de cristaux. Pour recueillir les cristaux, des lames de verre propres ont été placées au fond du flacon. Après incubation à 60 ° C pendant 3 jours, les lames ont été retirées et après lavage ainsi que séchage à 25 ° C pour une caractérisation ultérieure.

La morphologie et la densité des cristaux ont d'abord été analysées au microscope optique (Ti2-U, Nikon, Japon). La surface et le nombre de cristaux dans au moins cinq champs ont été estimés avec le logiciel Image J. De plus, le rapport entre la COM et l'oxalate de calcium dihydraté (COD) a été analysé en comptant tous les cristaux. La morphologie des cristaux sur la lame de verre a été examinée plus en détail par SEM (EVO, ZEISS, Allemagne) après un traitement de pulvérisation d'or. En particulier, deux types différents d'oxalate de calcium, à savoir COM et COD, ont été observés et photographiés. Pour évaluer davantage l'effet de divers inhibiteurs de cristaux sur la cristallisation de CaOx, une microscopie à force atomique (AFM, Asylum Research, USA) a été réalisée pour examiner les images topographiques de la surface du cristal (001), en particulier le phénomène de gravure. Les images ont été collectées à l'aide des pointes avec 60 N/m de constantes de ressort sous le mode tapotement (plage de balayage : 2 μm ; taux de balayage : 0,5 Hz).

La structure des cristaux a été validée avec XPS (Kratos, UK) et spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR, INVENIO R, Suisse). Le spectre FTIR de divers cristaux COM a été mesuré avec une portée de longueur d'onde de 1 000 à 4 000 cm-1. En ce qui concerne XPS, les spectres C 1s, N 1s et O 1s de divers cristaux COM, taurine, acide subérique, succinate, acide salicylurique et gentisique ont été ajustés à l'aide du logiciel CasaXPS.

La théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT) a été utilisée pour explorer théoriquement les interactions entre divers inhibiteurs cristallins et la surface de CaC2O4.42 La fonctionnelle de l'approximation généralisée du gradient (GGA) a été appliquée. La méthode Monkhorst-Pack a été appliquée dans le processus d'échantillonnage de la zone Brillouin. Le standard de convergence d'énergie était de 10−5 eV/atome.

Les énergies de liaison des molécules inhibitrices de cristaux, y compris les acides succinique, taurine, salicylurique, subérique et gentisique, sur les surfaces de CaC2O4 ont été calculées. Les surfaces CaC2O4 (100) et (021) ont été construites par les supercellules 2 × 2 et 2 × 1, respectivement. Un espace de vide de 15 Å a été appliqué pour empêcher les interactions. La méthode DFT-D2 a été appliquée pour calculer les interactions vdW entre les molécules d'inhibiteur cristallin et la surface de CaC2O4. Alors que la formule des énergies de liaison (Eb) était la suivante :

où \(E_{\left( {\rm{Molécule}} - {\rm{CaC}}_{2}{\rm{O}}_4\right)}\), et \(E_{{\rm {CaC}}_2{\rm{O}}_4}\) font référence aux énergies DFT de la surface de CaC2O4 adsorbée par la molécule, la surface de CaC2O4 propre, respectivement.

Cette étude a comparé géométriquement les structures congelées et relaxées de la surface de CaC2O4 avec ou sans la présence d'adsorbats (inhibiteur de croissance), comme indiqué dans nos travaux précédents. Une métrique de distance a été utilisée pour quantifier le déplacement des atomes relaxés à la surface du cristal de CaC2O4. Le déplacement moyen δ peut être calculé par la formule suivante :

Dans lequel Natoms fait référence au nombre d'atomes détendus sur la surface plane de CaC2O4.

De plus, les énergies moyennes de déplacement et de liaison entre le Ca2+ et les molécules inhibitrices de cristaux (c.-à-d. taurine, acide subérique, succinate, salicylurique, acide gentisique) ont été dérivées avec une méthode similaire.

Des rats mâles SD achetés à Chengdu Dossy Animals Factory, et ont été classés dans le groupe témoin à blanc, le groupe modèle de calculs rénaux et les groupes de traitement (acide citrique, taurine, acide subérique, succinate, acide salicylurique et gentisique), chaque groupe contenant au moins cinq rats. L'éthylène glycol a été utilisé pour construire le modèle de calculs rénaux avec les rats SD.54 Plus précisément, le modèle a été construit en alimentant en continu de l'eau potable contenant 1 % v/v d'EG pendant 28 jours, tandis que le groupe témoin n'a été alimenté qu'avec de l'eau potable. Au cours de la modélisation, le traitement a été effectué avec de l'acide citrique, de la taurine, de l'acide subérique, du succinate, de l'acide salicylurique et de l'acide gentisique, respectivement. La dose inhibitrice (200 mg/kg) utilisée pour le modèle de calculs rénaux chez le rat a été calculée sur la base de la concentration thérapeutique clinique d'acide citrique (le composant efficace de l'uralyt-U) qui a été convertie pour les rats en fonction de la surface corporelle. Par la suite, les rats ont été traités avec des solutions aqueuses de taurine, d'acide subérique, de succinate, d'acide salicylurique et d'acide gentisique par gavage quotidien pendant 28 jours. Tous les rats étaient vivants tout au long de l'expérience. Le poids initial de chaque rat a été enregistré et la quantité de gavage médicamenteux a été ajustée en fonction de son poids quotidien.

Les rats ont été anesthésiés, fixés en décubitus dorsal, le cœur entièrement exposé. 3 ml de sang ont été prélevés du ventricule droit avec un tube de prélèvement sanguin sous vide jetable, et les reins ont été récoltés. Les échantillons ont été laissés à 25°C pendant 15 min et centrifugés pendant 15 min. 1 mL de surnageant a été aspiré pour les dosages biochimiques. La morphologie des reins a été enregistrée par photographie. Et chaque rein a été pesé et enregistré. Les reins ont ensuite été stockés dans une solution fixatrice de paraformaldéhyde à 4% ou congelés pour une analyse ultérieure.

Les échantillons de rein ont été fixés dans une solution de formol à 10% pour l'inclusion de paraffine et sectionnés à une épaisseur de 10 μm pour la coloration. La formation de cristaux a été détectée sur la base de la coloration de Von Kossa. Les dépôts de cristaux ont été analysés par microphotographie optique et le logiciel Image J. Des sections de rein ont été soumises à (coloration PAS, et les lésions tubulaires ont été notées par la méthode de PaIIer : dilatation tubulaire et cellules épithéliales plates (1 point ); moulage tubulaire (2 points) ; cellules nécrotiques et exfoliées dans la lumière tubulaire sans débris (1 point ) ; pycnose des cellules épithéliales (1 point).55

Pour l'immunohistochimie (IHC), les coupes de rein ont été incubées dans du xylol, un gradient d'éthanol puis dans 3 % de H2O2 pour bloquer l'activité de la peroxydase endogène. Les anticorps CD44 (ab189524, Abcam), IL-6 (ab9324, Abcam) et OPN (ab11503, Abcam) ont été incubés à 4 ° C pendant la nuit. La section a été rincée dans du PBS et incubée avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP à une dilution de 1 : 200 pendant 1 h à 37 °C, exposée au DAB pour la détection de la HRP conjuguée. Et les images ont été évaluées avec l'outil Image J.

Quatre semaines après l'opération, des reins de rat ont été prélevés dans le groupe témoin, le groupe de modélisation et le groupe d'acide succinique (n = 3). Dans le processus d'extraction de l'ARN total, le kit RNeasy (Qiagen, Allemagne) a été utilisé pour conserver l'ARN obtenu à ultra-basse température. Selon les instructions correspondantes, TruSeq a été synthétisé via le kit d'ARN correspondant (Illumina, USA). Dans cette expérience de synthèse, tout d'abord, l'ARNm contenant le poly A a été purifié par des billes magnétiques. Ensuite, sur la base du schéma de kit correspondant, l'ARNm a été fragmenté de manière aléatoire pour obtenir un ADNc double brin. Ensuite, la réparation finale et le traitement de la queue dA ont été effectués pour fournir un support pour les opérations ultérieures. Le produit a été purifié et enrichi par PCR pour obtenir la banque d'ADNc requise. Qubit est appliqué à l'analyse quantitative de la bibliothèque purifiée ® 2.0 Fluorometer (Life Tech, USA) et l'analyseur 2100 (Agilent, USA) a été utilisé pour vérifier la bibliothèque, puis calcule et analyse la concentration molaire. Après dilution de la bibliothèque purifiée, des clusters ont été générés par cBot et testés. NovaSeq 6000 (Illumina, États-Unis) a été utilisé dans le processus de séquençage.

Utilisez Hisat2 pour mapper le fichier de séquence terminal apparié (fastq) au génome de référence Ensembl, puis convertissez le fichier SAM de sortie pour obtenir le fichier BAM. Pendant le tri, SAMtools 1.3.1 est appliqué pour convertir les lectures mappées pour former le fichier BAM, qui prend en charge l'analyse FPKM ultérieure. Les gènes ont été analysés par l'outil StringTie1.33b. L'analyse de l'expression différentielle (DEG) pour l'ARNm a été effectuée sur la base du paquet R edgeR, et les gènes avec un changement de pli supérieur à 1,5 et P <0,05 ont été considérés comme des DEG. Le tracé volcanique a été dessiné avec le progiciel EnhancedVolcano. L'expression génique standardisée de FPKM a été obtenue par traitement avec des outils de clustering dans le package R, et les clusters de gènes avec une expression similaire ont été déterminés sur cette base. Dans la carte thermique, les données d'expression génique sont normalisées par la formule y = (x-α)/λ, dans laquelle x fait référence à l'expression réelle, λ correspondant à la variance des échantillons. L'outil en ligne Metascape est utilisé pour l'analyse d'enrichissement GO. L'ensemble de données de DEG a été analysé par séquençage d'ARN et sa distribution a été déterminée. Lorsque P est <0,05, la voie est considérée comme significative

L'ARN total a été isolé des échantillons de rein par le réactif TRzol et l'ADNc a été préparé par transcription inverse basée sur le kit PrimeScript™ (Takara, Japon). La Q-PCR a été réalisée sur un système Lightcycler 96 (Roche, Suisse) pour détecter l'expression du gène au niveau de l'ARNm. Les amorces sont visibles en annexe Tableau complémentaire 6. Le programme des cycles thermiques : 95 °C pendant 30 s ; 40 cycles de 95 °C pendant 10 s et 60 °C pendant 30 s. Le niveau relatif d'expression génique par Q-PCR a été calculé avec une méthode 2-ΔΔCt.

Toutes les données ont été exprimées en moyenne ± SD. La différence statistique a été vérifiée avec un test t indépendant ou une analyse de variance unidirectionnelle avec le test de Tukey en utilisant SPSS 11.0. Le seuil significatif a été fixé à 0,05.

Toutes les données de cette recherche ont été présentées dans le document et/ou les informations supplémentaires. Les données brutes RNA-seq ont été déposées dans la base de données SRA avec le code d'accès PRJNA874063 et les données métabolomiques originales non ciblées ont été déposées dans MetaboLights avec le numéro d'accession MTBLS5921.

Ye, Z. et al. Le statut et les caractéristiques de la composition des calculs urinaires en Chine. BJU Int. 125, 801–809 (2020).

Article CAS Google Scholar

Li, H. et al. SLIPS-LAB-Un système de bioanalyse bioinspiré pour l'évaluation métabolique des calculs urinaires. Sci. Adv. 6, eaba8535 (2020).

Article CAS Google Scholar

Johri, N. et al. Une mise à jour et un guide pratique de la gestion des calculs rénaux. Néphron Clin. Pr. 116, c159–c171 (2010).

Article Google Scholar

Yu, H., Fan, X., Zhao, L. & Guo, X. Une nouvelle méthode de reconnaissance des gestes de la main basée sur le sEMG à 2 canaux. Technol. Soins de santé 26, 205–214 (2018).

Article Google Scholar

Alamani, BG & Rimer, JD Modificateurs moléculaires des calculs rénaux. Courant. Avis. Néphrol. Hypertension. Rév. 26, 256–265 (2017).

Article CAS Google Scholar

Duan, X. et al. (1)Étude métabolomique basée sur la RMN H du profilage métabolique de l'urine de patients souffrant de calculs rénaux. Urolithiase 48, 27–35 (2020).

Article CAS Google Scholar

Moe, OW Calculs rénaux : physiopathologie et prise en charge médicale. Lancette 367, 333–344 (2006).

Article CAS Google Scholar

Morgan, MS & Pearle, MS Prise en charge médicale des calculs rénaux. BMJ 352, i52 (2016).

Article Google Scholar

Geng, X., Sosa, RD, Reynolds, MA, Conrad, JC & Rimer, JD Alginate en tant qu'inhibiteur vert de la nucléation de la barytine et de la croissance des cristaux. Mol. Syst. Dés. Ing. 6, 508–519 (2021).

Article CAS Google Scholar

Kleinman, JG, Alatalo, LJ, Beshensky, AM & Wesson, JA Le polyanion acide poly(acide acrylique) empêche le dépôt de cristaux d'oxalate de calcium. Rein Int. 74, 919-924 (2008).

Article CAS Google Scholar

Kletzmayr, A. et al. Inhibiteurs de la cristallisation de l'oxalate de calcium pour le traitement des néphropathies à oxalate. Adv. Sci. 7, 1903337 (2020).

Article CAS Google Scholar

Fleisch, H. Inhibiteurs et promoteurs de la formation de calculs. Rein Int 13, 361–371 (1978).

Article CAS Google Scholar

Salama, AK et al. Incidence de la néphrolithiase après augmentation de la vessie chez les personnes atteintes de spina bifida. J. Pediatr. Urol. 521, e521–521.e527 (2021).

Google Scholar

Szymanski, KM et al. Les calculs vésicaux après une augmentation de la vessie ne sont pas ce qu'ils semblent être. J. Pediatr. Urol. 98, e91–e96 (2016).

Google Scholar

Posada-Ayala, M. et al. Identification d'une signature métabolomique urinaire chez les patients atteints d'insuffisance rénale chronique à un stade avancé. Rein Int. 85, 103–111 (2014).

Article CAS Google Scholar

Cacciatore, S. & Loda, M. Innovation en métabolomique pour améliorer les soins de santé personnalisés. Anne. N. Y Acad. Sci. 1346, 57–62 (2015).

Article CAS Google Scholar

Krzyszczyk, P. et al. Le rôle croissant de la médecine de précision et personnalisée dans le traitement du cancer. Technol. (Singap. Word Sci.) 6, 79–100 (2018).

Google Scholar

Abbiss, H., Maker, GL & Trengove, RD Approches métabolomiques pour le diagnostic et la compréhension des maladies rénales. Métabolites 9, 34 (2019).

Article CAS Google Scholar

Gao, S. et al. Analyse métabolomique de la néphrolithiase à l'oxalate de calcium induite par l'hydroxy-L-proline chez le rat basée sur la spectrométrie de masse à temps de vol quadripolaire par chromatographie liquide ultra-haute performance. Sci. Rep. 6, 30142 (2016).

Article CAS Google Scholar

Wang, X. et al. Identification de biomarqueurs urinaires pour la lithiase urinaire à l'oxalate de calcium chez l'adulte basée sur UPLC-Q-TOF/MS. J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomédical. Vie Sci. 1124, 290-297 (2019).

Article CAS Google Scholar

Zhang, XZ et al. Sous-muqueuse de l'intestin grêle réticulée aux procyanidines : un patch vésical favorise la régénération des muscles lisses et la restauration de la fonction vésicale dans un modèle de lapin. Bioact. Mater. 6, 1827–1838 (2021).

Article CAS Google Scholar

Chung, J. et al. Les modificateurs moléculaires révèlent un mécanisme d'inhibition pathologique de la croissance cristalline. Nature 536, 446–450 (2016).

Article CAS Google Scholar

Mijangos, F., Celaya, MA, Gainza, FJ, Imaz, A. & Arana, E. Balayage linéaire SEM-EDX : un nouvel outil pour l'analyse morpho-compositionnelle des bandes de croissance dans les calculs urinaires. J. Bio Inorg. Chim. 25, 705–715 (2020).

Article CAS Google Scholar

Mackiewicz, AG, Klekiel, T., Kurowiak, J., Piasecki, T. & Bedzinski, R. Détermination des conditions de charge du stent dans l'urètre du lapin blanc de Nouvelle-Zélande. J. Fonction. Biomatière. 11, 70 (2020).

Article Google Scholar

Singh, VK & Rai, PK Techniques d'analyse des calculs rénaux et rôle des éléments majeurs et traces sur leur pathogenèse : une revue. Biophys. Rév. 6, 291–310 (2014).

Article CAS Google Scholar

Sivaguru, M. et al. La géobiologie révèle comment les calculs rénaux humains se dissolvent in vivo. Sci. Rep. 8, 13731 (2018).

Article Google Scholar

Evan, AP, Worcester, EM, Coe, FL, Williams, J. Jr. & Lingeman, JE Mécanismes de formation de calculs rénaux humains. Lithiase urinaire 43 (Suppl 1), 19–32 (2015).

Article Google Scholar

Khan, SR et al. Calculs rénaux. Nat. Rév. Dis. Prim. 2, 16008 (2016).

Article Google Scholar

Bouatra, S. et al. Le métabolome de l'urine humaine. PLoS ONE 8, e73076 (2013).

Article CAS Google Scholar

Chung, J., Sosa, R. & Rimer, JD Élucider les effets de la spéciation de l'acide polyprotique dans la cristallisation de l'oxalate de calcium. Crist. Croissance Dés. 17, 4280–4288 (2017).

Article CAS Google Scholar

Sosa, RD, Geng, X., Conrad, JC, Reynolds, MA et Rimer, JD Suppression de la cristallisation du sulfate de baryum avec de l'hydroxycitrate : un double inhibiteur de nucléation et de croissance. Chim. Mater. 33, 6997–7007 (2021).

Article CAS Google Scholar

Chen, XW, Huang, WB, Sun, XY, Xiong, P. & Ouyang, JM Activité antioxydante des polysaccharides sulfatés de Porphyra yezoensis et leur effet régulateur sur la croissance des cristaux d'oxalate de calcium. Mater. Sci. Ing. C. Mater. Biol. Appl. 128, 112338 (2021).

Article CAS Google Scholar

Ristić, RI, Sherwood, JN & Wojciechowski, K. Évaluation de la souche dans les petits cristaux de chlorate de sodium et sa relation avec la dispersion du taux de croissance. J. Crist. Croissance 91, 163-168 (1988).

Article Google Scholar

Ou, Y. et al. Inhibition de la macromolécule urinaire d'héparine sur l'agrégation des cristaux nano-COM et nano-COD. Molécules 20, 1626–1642 (2015).

Article Google Scholar

Nguyen, VH et al. Un dosage semi-quantitatif pour mesurer la dégradation des glycosaminoglycanes par le microbiote urinaire. Devant. Cellule infectée. Microbiol. 11, 803409 (2021).

Article CAS Google Scholar

Guerra, A. et al. Néphrolithiase calcique idiopathique à composition d'oxalate de calcium pur : corrélats cliniques du rapport calculs oxalate de calcium dihydraté/monohydraté (COD/COM). Lithiase urinaire 48, 271–279 (2020).

Article CAS Google Scholar

Li, S. et al. Une nouvelle perspective de l'acide gallique sur la nucléation de l'oxalate de calcium. Crist. Croissance Dés. 20, 3173–3181 (2020).

Article CAS Google Scholar

Shtukenberg, AG, Hu, L., Sahota, A., Kahr, B. & Ward, MD Perturbation de la croissance des cristaux par reconnaissance moléculaire : thérapies de créateurs pour la prévention des calculs rénaux. Acc. Chim. Rés. 55, 516-525 (2022).

Article CAS Google Scholar

Li, S. et al. Découverte de molécules inhibitrices de la cristallisation pathologique des calculs rénaux CaOx à partir d'extraits naturels d'herbes médicinales. J. Ethnopharmacol. 284, 114733 (2022).

Article CAS Google Scholar

Buchalski, B. et al. Les effets de l'inactivation de l'hydroxyproline déshydrogénase sur l'excrétion urinaire d'oxalate et de glycolate dans des modèles murins d'hyperoxalurie primaire. Biochim Biophys. Acta Mol. Base Dis. 1866, 165633 (2020).

Article CAS Google Scholar

Fernández, D., Ortega-Castro, J. & Frau, J. Étude théorique de la puissance d'inhibition de la croissance cristalline HAP du pyrophosphate, de l'étidronate, du citrate et du phytate. Décryptage de la conformation adsorbée du phytate sur la surface HAP (001). Appl. Le surf. Sci. 408, 110-116 (2017).

Article Google Scholar

Chung, J. et al. Facteurs différenciant l'efficacité des acides polyprotiques comme inhibiteurs de la cristallisation de l'oxalate de calcium dans la maladie des calculs rénaux. Crist. Croissance Dés. 18, 5617–5627 (2018).

Article CAS Google Scholar

Zaki, S., Jahan, N., Kalim, M. & Islam, G. Activité antilithiatique in vitro de l'extrait hydro-alcoolique d'écorce de Cinnamomum zeylanicum Blume sur la cristallisation de l'oxalate de calcium. J. Intégr. Méd. 17, 273-281 (2019).

Article Google Scholar

Chaiyarit, S. & Thongboonkerd, V. Les modifications oxydatives font passer les activités modulatrices des protéines urinaires de l'inhibition à la promotion de la cristallisation, de la croissance et de l'agrégation de l'oxalate de calcium. Mol. Protéine cellulaire. 20, 100151 (2021).

Article CAS Google Scholar

Chen, Z., Wang, C., Zhou, H., Sang, L. et Li, X. Modulation de la cristallisation de l'oxalate de calcium par le thé vert couramment consommé. Crystengcomm 12, 845–852 (2010).

Article CAS Google Scholar

Li, Z., Chang, L., Ren, X., Hu, Y. & Chen, Z. Modulation de la cristallisation des calculs rénaux chez le rat et voie relative du stress oxydatif par le polyphénol du thé vert. ACS oméga 6, 1725–1731 (2021).

Article CAS Google Scholar

Brent, J. et al. Fomépizole pour le traitement de l'empoisonnement à l'éthylène glycol. NEJM 340, 832–838 (1999).

Article CAS Google Scholar

Alexander, RT, Fuster, DG et Dimke, H. Mécanismes sous-jacents à la lithiase calcique. Annu. Rév. Physiol. 84, 559-583 (2022).

Article CAS Google Scholar

Vasudevan, V., Samson, P., Smith, AD et Okeke, Z. Le cadre génétique pour le développement de la néphrolithiase. Asiatique J. Urol. 4, 18-26 (2017).

Article Google Scholar

Chen, DHC, Kaung, H.-LC, Miller, CM, Resnick, MI & Marengo, SR Analyse par micropuces des modifications du phénotype rénal dans le modèle de lithiase urinaire à l'éthylène glycol chez le rat : potentiel et pièges. BJU Int. 94, 637–650 (2004).

Article CAS Google Scholar

Saenz Medina, J. et al. Lithiase urinaire et dysfonction endothéliale rénale. Modèle expérimental de rat hyperoxalurie. EUR. Urol. 79, S327 (2021).

Article Google Scholar

Zhao, YW et al. La préprotection des polysaccharides du thé avec différents poids moléculaires peut réduire l'adhérence entre les cellules épithéliales rénales et les cristaux d'oxalate de nano-calcium. Oxyde. Méd. Cellule. Longev. 2020, 1817635 (2020).

Google Scholar

Carney, EF L'homéostasie du succinate protège contre la lithogenèse et l'hypertension. Nat. Rév. Néphrol. 15, 255-255 (2019).

Google Scholar

Le Dudal, M. et al. Stiripentol protège contre la néphrolithiase à l'oxalate de calcium et l'empoisonnement à l'éthylène glycol. J.Clin. Investir. 129, 2571-2577 (2019).

Article Google Scholar

Desanti De Oliveira, B. et al. Néphrologie moléculaire : types de lésions tubulaires aiguës. Nat. Rév. Néphrol. 15, 599–612 (2019).

Article CAS Google Scholar

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Cette étude a été parrainée conjointement par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32171351), le projet "1.3.5" pour les disciplines d'excellence, West China Hospital, Sichuan University (Grant No. ZYJC18002), Med-X Innovation Programme du Med-X Center for Materials, Université du Sichuan (Grant No. MCM202104), le projet financé par la China Postdoctoral Science Foundation (2022M722277) et le Fonds d'innovation interdisciplinaire postdoctoral de l'Université du Sichuan. Nous remercions Mme Lei Wu et Bo Su de la plate-forme d'histologie et d'imagerie, Core Facilities of West China, Université du Sichuan, M. Yun-fei Tian et Shu-guang Yan du Centre d'analyse et de test de l'Université du Sichuan, Université du Sichuan, et Mme Nian-guo Zhu de l'Institute of Respiratory Health, West China Hospital, Sichuan University pour les supports techniques. Nous remercions Xi-jing Yang et Xiao-ting Chen du Centre d'expérimentation animale de l'hôpital de Chine occidentale pour leur aide dans les expérimentations animales.

Laboratoire d'ingénierie des cellules souches et des tissus, Institut de recherche orthopédique, Département d'orthopédie, Laboratoire clé d'État de biothérapie, Hôpital de Chine occidentale, Université du Sichuan, Chengdu, Sichuan, 610041, Chine

Xiu-zhen Zhang, Xiong-xin Lei, Yan-lin Jiang, Long-mei Zhao, Chen-yu Zou, Ya-xing Li, Rui Wang, Qian-jin Li, Qiu-zhu Chen, Ming-hui Fan, Yu- ting Song, Wen-qian Zhang, Jesse Li-Ling et Hui-qi Xie

Département d'urologie, Institut d'urologie, Hôpital de Chine occidentale, Université du Sichuan, Chengdu, Sichuan, 610041, Chine

Yun-jin Bai

Centre de recherche de l'hôpital de Chine occidentale, Université du Sichuan, Chengdu, Sichuan, 610041, Chine

Yi Zhang

Département de génétique médicale, West China Second University Hospital, Chengdu, Sichuan, 610041, Chine

Jesse Li-Ling

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XZZ, HQX et JLL ont conçu l'idée et préparé le manuscrit. XZZ, XXL et CYZ ont construit un modèle et une analyse des calculs rénaux chez le rat. XZZ, YLJ et YJB ont construit un modèle et une analyse des calculs vésicaux de lapin. XZZ, LMZ, CYZ, RW, QJL et QZC ont effectué une cristallisation et une analyse COM. XZZ, XXL, CYZ, LMZ, RW et QJL étaient les auteurs principaux, avec des contributions de tous les auteurs. Tous les auteurs ont approuvé le manuscrit final. XZZ, LMZ et XXL ont effectué un traitement métabolomique non ciblé et des données de séquençage d'ARN.

Correspondance avec Hui-qi Xie.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Zhang, Xz., Lei, Xx., Jiang, Yl. et coll. Application de la métabolomique à la lithiase urinaire : la découverte et l'utilisation du succinate. Sig Transduct Target Ther 8, 41 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01311-z

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Reçu : 09 septembre 2022

Révisé : 04 janvier 2023

Accepté : 10 janvier 2023

Publié: 21 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41392-023-01311-z

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