Structure cristalline d'un élément de réplication d'ARN de trèfle 5 'entéroviral hautement conservé

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1955 (2023) Citer cet article

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L'extrémité 5' extrême du génome de l'ARN de l'entérovirus contient un domaine conservé semblable à une feuille de trèfle qui recrute les protéines 3CD et PCBP nécessaires à l'initiation de la réplication du génome. Ici, nous rapportons la structure cristalline à une résolution de 1,9 Å de ce domaine du génome CVB3 en complexe avec un anticorps chaperon. L'ARN se replie en une jonction antiparallèle à quatre voies de type H comprenant quatre sous-domaines avec des hélices sA-sD et sB-sC empilées de manière coaxiale. Les interactions à longue portée entre un A40 conservé dans la boucle sC et l'hélice Py-Py dans le sous-domaine sD organisent des orientations presque parallèles des hélices sA-sB et sC-sD. Nos études RMN confirment que ces interactions à longue portée se produisent en solution et sans le chaperon. Les analyses phylogénétiques indiquent que notre structure cristalline représente une architecture conservée de domaines entéroviraux de type trèfle, y compris les interactions A40 et Py-Py. Les études de liaison aux protéines suggèrent en outre que l'architecture en forme de H fournit une plate-forme prête à l'emploi pour recruter 3CD et PCBP2 pour la réplication virale.

Le genre d'entérovirus de la famille des Picornaviridae comprend de nombreux virus pathogènes responsables de nombreuses maladies humaines, telles que le rhume, la poliomyélite, la paralysie flasque aiguë et la myocardite1,2,3. Ces virus contiennent un génome d'ARN simple brin sens (+) avec environ 7500 nucléotides (nts), qui est polyadénylé à l'extrémité 3′ et lié de manière covalente avec la protéine virale VPg à l'extrémité 5′ (Fig. 1a)4 ,5,6,7. Le génome entier est constitué d'un seul cadre de lecture ouvert (ORF) flanqué des régions non traduites 5 'et 3' hautement conservées (UTR). Le 5′-UTR d'environ 750 nt abrite des domaines d'ARN modulaires essentiels à la traduction et à la réplication du génome viral dans les cellules hôtes (Fig. 1 supplémentaire). Environ 660 nt du 5′-UTR de la position 90 à 750, situé immédiatement en amont de l'ORF, contribuent à un site d'entrée interne du ribosome (IRES) qui favorise la traduction du génome viral par un mécanisme indépendant de la coiffe8,9,10,11. Les 90 nt restants à l'extrémité 5 'd'un génome entéroviral sont essentiels pour la réplication et il a été proposé d'adopter une structure secondaire d'ARN semblable à une feuille de trèfle (5'CL) qui sert de plate-forme pour intégrer les facteurs protéiques viraux et cellulaires requis pour initier la réplication du génome viral8,12,13,14,15. Nous rapportons ici une structure cristalline à haute résolution d'un ARN de trèfle entéroviral intact d'un membre de l'espèce d'entérovirus B - le coxsackievirus B3 (CVB3).

un schéma d'un génome d'entérovirus illustrant l'emplacement du 5′CL et sa structure secondaire proposée avec des sites de liaison putatifs pour les protéines virales 3CD et PCBP hôtes. b Structure secondaire de la construction de cristallisation CVB3 5'CL2a basée sur une analyse biochimique précédente, où le motif 5'-GAAACAC-3' de l'épitope de liaison Fab BL3-6 remplace la boucle L2 du sous-domaine sB. Les nucléotides colorés en gris représentent les mutations ou insertions par rapport à la séquence sauvage. c La structure cristalline du CVB3 5′CL2a cocristallisée avec le Fab BL3-6 et résolue à une résolution de 1,9 Å. Le Fab est obscurci dans les vues tournées de la structure de l'ARN pour plus de clarté. Les panneaux de figures et les étiquettes correspondantes sont colorés de manière analogue pour faciliter la comparaison.

Le 5′CL est hautement conservé parmi tous les membres du genre entérovirus. En raison d'une telle conservation élevée des caractéristiques structurelles parmi les 5'CL entéroviraux, il a été démontré que les génomes entéroviraux chimériques avec des 5'CL échangés génèrent des particules virales viables16,17,18. La structure secondaire d'ARN proposée se compose de quatre sous-domaines hautement organisés désignés sA, sB, sC et sD (Fig. 1a). Le sous-domaine sA forme la tige de base de la feuille de trèfle, tandis que les sous-domaines sB, sC et sD se replient chacun en une structure tige-boucle distincte. Le sous-domaine sD recrute la protéine de fusion virale 3CD - un précurseur de la protéase virale 3C et de l'ARN polymérase virale dépendante de l'ARN (RdRp) D - grâce à des interactions spécifiques de la boucle sD avec la protéase 3C17,19,20,21. Le sous-domaine sB avec une séquence riche en C dans sa boucle recrute la protéine de liaison poly(C) de l'hôte (PCBP) pour faciliter la circularisation du génome viral par des interactions avec la protéine de liaison poly(A) (PABP) complexée avec les 3 Queue poly(A) à extrémité ′19,22,23,24,25,26,27,28,29. Un domaine d'ARN tige-boucle, cre, dans la région codante 2C du génome viral interagit également avec le 3CD30,31,32, favorisant l'uridylation de la protéine virale VPg31,33, qui sert ensuite d'amorce pour le (-) synthèse d'ARN à brin par le RdRp D30,34. De plus, il a également été démontré que la séquence et l'intégrité structurelle des 5'CL influencent l'uridylation et la stabilité génomique du VPg, soulignant plusieurs rôles critiques des caractéristiques structurelles de l'ARN dans les 5'CL entéroviraux. Malgré des pressions de sélection intenses, la conservation élevée du 5′CL dans les génomes entéroviraux met également en évidence les exigences virales pour préserver les structures d'ARN primaires, secondaires et tertiaires du 5′CL pour les interactions avec les protéines virales et hôtes au cours du génome viral. réplication. Cependant, nous manquons des structures tridimensionnelles à haute résolution de la 5′CL entérovirale intacte, ce qui limite notre compréhension de ce processus virologique fondamental qui a un énorme potentiel pour développer des thérapies ciblées contre les infections entérovirales.

Plusieurs méthodes biochimiques et biophysiques ont été utilisées pour étudier les structures des sous-domaines entéroviraux 5′CL et leurs interactions moléculaires avec le PCBP et les protéines 3C ou 3CD36,37,38,39,40,41,42,43,44. Des études antérieures se sont concentrées sur la compréhension des structures sD isolées à l'aide de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), qui comprenait les structures basées sur la RMN des sous-domaines sD de CVB3, du rhinovirus B14 (RVB14) et d'une séquence consensus entérovirale36,37,38,40,43. Conformément au sondage chimique et aux analyses SHAPE (acylation sélective de l'hydroxyle en 2′ analysée par extension d'amorce) dans le contexte des 5′CL pleine longueur ou des 5′-UTR entiers39, 42, 45, les structures RMN ont montré une structure bien conservée. structure des variantes sD qui adopte une architecture en épingle à cheveux avec une tige hélicoïdale en forme de A coiffée d'une tétraboucle. Fait intéressant, les structures ont également révélé une région appariée de bases pyrimidine-pyrimidine (Py-Py) unique dans la tige sD, qui devait auparavant former un renflement symétrique de 3 × 3 nt. La séquence et la structure de cette région sont bien conservées parmi tous les entérovirus, et comme montré précédemment pour CVB3, la délétion d'un nucléotide, mais pas la mutation ponctuelle compensatoire, dans cette région réduit les interactions sD avec la protéase 3C, suggérant que la l'intégrité des caractéristiques structurelles formées dans la région Py-Py est importante pour la liaison 3C14,20. Cependant, les données RMN n'ont pas soutenu les interactions directes entre cette région et la protéase 3C. Les interactions directes avec la protéine n'impliquaient que les nucléotides de la boucle sD et deux paires de bases GC flanquant la région Py-Py38. Plus tard, Warden et al. ont rapporté une structure RMN d'une séquence sB isolée de 24 nt du RVB14, qui se replie en épingle à cheveux avec une tige hélicoïdale prédominante de forme A coiffée par une boucle désordonnée de 8 nt41. La région riche en C dans la boucle, le site de reconnaissance du PCPB hôte, a été exposée au solvant, conformément aux études biochimiques antérieures41. La région de la tige avait un sillon majeur accessible, indiquant un site potentiel pour les interactions protéiques. Plus récemment, Warden et al. ont dérivé les modèles structurels du RVB14 5′CL pleine longueur en utilisant les techniques de RMN et de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS)43. Les modèles structuraux proposés ont adopté deux conformations selon la présence et l'absence de Mg2+ dans la solution. En l'absence de Mg2+, le 5′CL a pris une conformation étendue similaire à une structure de jonction à quatre voies de type cK avec les sous-domaines sB et sD résidant presque perpendiculairement l'un à l'autre, alors qu'en présence de Mg2+, il a pris une structure plus compacte conformation juxtaposant ces sous-domaines sB et sD43. Néanmoins, sans les structures à haute résolution d'autres sous-domaines (sA et sC) et un 5′CL intact, les arrangements topologiques des sous-domaines 5′CL et les caractéristiques structurelles qui facilitent leurs interactions de liaison avec le 3C viral, le 3CD et l'hôte Les protéines PCPB restent largement méconnues.

Ici, nous utilisons un fragment d'anticorps synthétique (Fab) comme chaperon pour cristalliser et déterminer la structure cristalline de résolution de 1,9 Å du 5′CL pleine longueur de CVB3. L'ARN se replie en une architecture de jonction à quatre voies de type H sans nucléotides non appariés dans la jonction. Les sous-domaines s'assemblent en deux ensembles d'hélices empilées coaxialement, chaque empilement coaxial formant presque une hélice continue en forme de A. Au sein de la jonction à quatre voies, l'hélice sA s'empile sur l'hélice sD et l'hélice sB sur l'hélice sC. La structure secondaire dérivée du cristal s'accorde bien avec celles dérivées précédemment du sondage biochimique, SHAPE et des études RMN de sous-domaines isolés de divers 5'CL. Étonnamment, notre structure cristalline a révélé une interaction tertiaire sans précédent entre la boucle sB hautement conservée et la région Py-Py de l'hélice sD. Ces interactions concordent bien avec nos résultats de RMN en solution, indiquant que les caractéristiques structurelles observées dans notre structure cristalline représentent celle de la solution. L'arrangement unique de ces caractéristiques structurelles suggère également qu'elles sont importantes pour stabiliser la structure globale du 5′CL qui positionne parfaitement ses sous-domaines sB et sD pour les interactions avec les protéines 3C ou 3CD et PCBP, ce qui est en accord avec nos études de liaison utilisant CVB3 recombinant. Protéase 3C et PCBP2 humaine utilisant la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) et l'électrophorèse sur gel. Notre détermination structurelle à haute résolution d'un 5′CL intact d'un entérovirus facilitera les efforts pour comprendre l'organisation structurelle et les rôles fonctionnels du 5′CL lors de la réplication du génome entéroviral. De plus, étant donné un degré élevé de conservation de la séquence et de la structure secondaire des 5′CL parmi les entérovirus, cette étude aidera à comprendre le mécanisme de réplication entérovirale médiée par 5′CL, qui a un énorme potentiel pour développer des thérapies ciblées pour l'inhibition de la réplication virale, conduisant potentiellement à à un traitement plus efficace de nombreuses maladies humaines causées par les infections entérovirales.

Le CVB3 5′-UTR contient sept domaines modulaires comprenant des structures secondaires d'ARN hautement organisées (Fig. 1 supplémentaire)39. Les domaines désignés II à VII comprennent les éléments IRES responsables de la traduction du génome viral via un mécanisme indépendant de la coiffe, tandis que le domaine I représente la structure 5'CL8,9,10,11,12,13,14,15. La construction de cristallisation de type sauvage (WT) de 90 nt de l'isolat CVB3 28 englobe l'intégralité de la 5'CL (nts 2 à 88) avec deux paires GC supplémentaires au début de l'hélice sA (Fig. 2 supplémentaire). Nos efforts pour cristalliser cette construction WT 5′CL ont été infructueux ; par conséquent, nous avons suivi une stratégie de cristallisation d'ARN assistée par chaperon. Nous avons développé et utilisé des fragments Fab comme chaperons pour la cristallisation du complexe Fab-ARN et comme modèles de remplacement moléculaire pour la mise en phase initiale au cours du processus de détermination de la structure46,47,48,49,50,51. L'une des approches de cette stratégie utilise un module Fab-épitope, qui consiste à greffer l'épitope ARN dans l'ARN cible pour permettre sa formation de complexe avec le Fab, permettant la cristallisation ultérieure du complexe Fab-ARN46,47,48,49,50 ,51. Entre autres, Fab BL3-6 a été un chaperon très efficace pour cristalliser et déterminer les structures cristallines à haute résolution de plusieurs cibles d'ARN46,47,49,50,52,53. Le Fab se lie à un ARN en épingle à cheveux avec une séquence pentaloop 5′-AAACA-3′ fermée de préférence par une paire GC, ce qui permet une ingénierie facile de la séquence épitopique dans l'ARN cible46,47,49,50,52,53.

Sur la base des structures secondaires putatives du 5′CL dérivées d'études biochimiques de sondage, de SHAPE et de RMN sur le 5′CL intact et ses domaines isolés, nous avons préparé trois constructions d'ARN distinctes, 5′CL2, 5′CL3 et 5′CL4 , pour la cristallisation en remplaçant les boucles L2, L3 et L4 du WT 5′CL par la séquence 5′-GAAACAC-3′ pour créer un site de liaison pour le Fab BL3-6 dans chaque construction d'ARN (Fig. 2 supplémentaire) . Les tests d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif confirment que Fab BL3-6 se lie explicitement à ces trois constructions d'ARN (Fig. 3 supplémentaire), conformément aux rapports précédents pour d'autres constructions d'ARN greffées avec cette séquence de liaison Fab BL3-6. Étant donné que Fab BL3-6 se lie à sa séquence épitopique uniquement sous forme d'ARN en épingle à cheveux, ces observations ont également indiqué que chaque sous-domaine 5′CL, sB, sC et sD, adopte probablement des structures tige-boucle distinctes, conformément aux études biochimiques et RMN précédentes.

Suite aux tests de liaison, nous avons mis en place les essais de cristallisation pour les trois constructions d'ARN, 5'CL2, 5'CL3 et 5'CL4, en complexe avec Fab BL3-6. Nous avons observé des cristaux pour les complexes 5′CL2 et 5′CL4 mais pas pour le complexe 5′CL3. Sur les 480 conditions criblées pour chaque complexe, le complexe 5'CL2 a cristallisé dans moins de conditions (2) que 5'CL4 (16). Les essais analogues pour les deux constructions sans Fab BL3-6 n'ont produit aucun cristal, suggérant un rôle substantiel du Fab dans la facilitation de la cristallisation de 5'CL2 et 5'CL4. Malheureusement, les cristaux de ces complexes ne diffractaient qu'à une résolution d'environ 8 Å, ce qui était insuffisant pour une détermination de structure à haute résolution. Pour obtenir des cristaux de meilleure qualité et un ensemble de données de diffraction à haute résolution, nous avons préparé plusieurs constructions mutantes 5′CL2 pour mettre en place les essais de cristallisation en complexe avec Fab BL3-6. Pour chaque mutant de boucle L2, nous avons prédit les modèles en épingle à cheveux sD à l'aide de ROSIE54,55, en accordant une attention particulière à la conformation de la tétraboucle L2. Les modèles prédisent que le mutant G66C adopte une conformation de tétraboucle de type GNRA par rapport à une tétraboucle de type UNCG pour le L2 de type sauvage (Fig. 4 supplémentaire). Comme les tétraboucles de type GNRA sont connues pour faciliter les contacts cristallins56, nous avons utilisé cette mutation G66C dans le contexte du 5′CL2, désigné 5′CL2a (Fig. 1b), qui a donné des cristaux robustes en complexe avec le Fab qui diffractait à 1,9 Å résolution. Pour le processus de résolution de structure ultérieur avec ces données, nous avons utilisé une structure cristalline précédente de Fab BL3-6 (code PDB : 6B14) 46 comme modèle de remplacement moléculaire et avons facilement obtenu les phases initiales. Après le phasage initial, la carte de densité électronique à haute résolution nous a permis de modéliser les nucléotides d'ARN sans ambiguïté. La structure a ensuite été résolue par des cycles itératifs de reconstruction et de raffinement du modèle à une résolution de 1,9 Å, et le modèle final du complexe 5′CL2a-BL3-6 a convergé avec Rwork = 20,9% et Rfree = 25,9%. Les détails de la collecte de données et des statistiques de raffinement sont présentés dans le tableau supplémentaire 1. Le modèle structurel final du complexe 5′CL2a-BL3-6 avec le 2|Fo | -|Fc | La carte de densité d'électrons et celle colorée en fonction des facteurs B cristallographiques sont illustrées dans les figures supplémentaires. 5 et 6, respectivement.

L'unité cristallographique asymétrique (a = 122,20, b = 48,70, c = 144,65, ɑ = 90, β = 112,92 et γ = 90) avec un groupe d'espace de réseau C 1 2 1 contient un seul complexe Fab-ARN. L'analyse de la zone interfaciale au sein de la cellule unitaire à l'aide de PDBePISA57 a révélé que, y compris l'interface de liaison Fab-ARN, les contacts cristallins Fab-Fab, Fab-ARN et ARN-ARN représentent environ 142, 2993 et ​​266 Å2, respectivement. Alors que Fab réalise la majorité des contacts cristallins (~ 92%, y compris l'interface de liaison Fab-ARN), les interactions ARN-ARN par empilement coaxial d'hélices sA liées à la symétrie dans le réseau cristallin (Fig. 7 supplémentaire) représentent environ 8% de la zone interfaciale. Les contacts Fab-ARN dans le réseau cristallin autres que l'interface de liaison impliquent principalement des interactions électrostatiques du

Squelette d'ARN avec des chaînes latérales de lysine et d'arginine provenant des chaînes lourdes et légères des Fab liés à la symétrie, indiquant que Fab facilitait le tassement des cristaux en neutralisant les charges négatives à la surface de l'ARN (voir la Fig. 8 supplémentaire pour plus de détails).

La structure cristalline de la construction 5′CL2a à 90 nucléotides suppose une architecture de jonction antiparallèle à quatre voies compacte de type H composée d'une tige et de trois régions tige-boucle (Fig. 1c). Les quatre tiges hélicoïdales composant la jonction à quatre voies désignées P1, P2, P3 et P4 s'assemblent en deux ensembles d'hélices empilées coaxialement, où P1 s'empile sur P4 et P2 s'empile sur P3. Au sein de la jonction à quatre voies, sans nucléotides non appariés et empilement parfait des brins croisés de l'hélice P1 G10 avec l'hélice P4 G47 et l'hélice P2 C11 avec l'hélice P3 C46, ​​chaque ensemble de ces empilements coaxiaux forme presque une hélice continue de forme A. Comme prévu, la boucle L2 ferme l'hélice P2 et se lie au Fab BL3-6, conformément aux interactions Fab-boucle observées pour d'autres structures cristallines complexes ARN-BL3-646,47,49,50,52,53. De même, une boucle trinucléotidique L3 et une boucle tétranucléotidique L4 ferment respectivement les hélices P3 et P4. Un renflement de dinucléotide avec U49 et A50 sépare l'hélice P4 en sous-hélices, P4a et P4b, où l'U49 reste dans la pile hélicoïdale continue, et A50 se retourne hors de l'hélice pour interagir avec une molécule Fab de compagnon de symétrie dans le réseau cristallin ( Fig. 8 supplémentaire). L'hélice P4b contient une région Py-Py avec une paire de bases U•U de chaque côté de la paire de bases centrale C•U.

La structure secondaire dérivée du cristal du 5′CL2a (Fig. 2a) en termes d'hélices à paires de bases (P1, P2, P3 et P4), de renflement de dinucléotide, de région à paires de bases Py-Py et de boucles (L2, L3 et L4) est bien compatible avec le modèle structurel secondaire CVB3 5′CL proposé précédemment dans le contexte d'une 5′-UTR complète basée sur l'analyse de la réactivité SHAPE et le sondage biochimique avec du sulfate de diméthyle (DMS), 1-Cyclohexyl-3-( 2-morpholinoéthyl) carbodiimide métho-p-toluènesulfonate (CMCT) et Ketoxal (Fig. 1b, voir Fig. 9 supplémentaire pour plus de détails)39,42,45. De plus, les structures de l'ensemble du sous-domaine sD et de l'hélice sB sont presque identiques à celles déterminées précédemment de manière isolée par des approches de RMN en solution (Fig. 9 supplémentaire) 37,38,40,43, suggérant que notre structure cristalline 5′CL2a représente sa conformation de la solution.

a La structure secondaire dérivée du cristal de la construction CVB3 5′CL2a. La ligne pointillée indique les interactions tertiaires entre la boucle L3 A40 et la région Py-Py de l'hélice P4. b Les interactions tertiaires entre les sous-domaines sA et sB. c Structure de la boucle trinucléotidique dans le sous-domaine sC. d Superposition des tiges-boucles 5′-ccAUUgg-3′ et 5′-ccUCUgg-3′ (RMSD = 0,44 Å) à partir des structures cristallines de CVB3 5′CL2a (triboucle rouge avec tige violette) et Agrobacterium tRNALeu (jaune , code APB : 5AH5)60. Seuls les nucléotides de la boucle sont présentés en détail pour plus de clarté. e Structure du renflement de dinucléotide dans l'hélice P4 du sous-domaine sD. Les lignes pointillées noires et les sphères rouges dans (b) et (e) reflètent les hétéroatomes dans les distances de liaison hydrogène et les molécules d'eau, respectivement. Le maillage gris représente le 2|Fo | -|Fc | carte de densité électronique au niveau de contour 1σ et rayon de découpe 1,8 Å.

Dans la structure cristalline de 5′CL2a, les dix premiers nucléotides (G1–G10, extrémité 5′) forment des paires de bases canoniques Watson-Crick avec les dix derniers nucléotides (C81–C90, extrémité 3′) pour constituer le P1 hélice, représentant l'ensemble du sous-domaine sA (Fig. 2a, b). Au sein de la jonction P1 – P2, un virage serré entre G10 et C11 se produit, pliant toute l'hélice P2 pour la positionner presque parallèlement à l'hélice P1 (Fig. 2a, b). L'hélice P2 est ensuite coiffée par la boucle L2 - le site de liaison du Fab BL3-6, formant la structure complète du sous-domaine sB (Fig. 2a, b). Dans le WT 5'CL, la boucle L2 devrait former un motif riche en C de huit nucléotides qui constitue le site de liaison du PCBP (Fig. 2 supplémentaire). En excluant la paire de bases G20-C26 de fermeture du motif de liaison BL3-6, l'hélice P2 est composée de neuf paires de bases Watson-Crick, formant une hélice de forme A typique (Fig. 2b), ce qui est cohérent avec le précédent. le sondage biochimique et les modèles RMN du sous-domaine sB de RVB14, indiquant que cette structure en hélice sB est bien conservée parmi les entérovirus. De plus, nous avons observé des contacts tertiaires entre les squelettes des hélices P1 et P2 par le biais d'interactions de liaisons hydrogène directes et médiées par l'eau, stabilisant les juxtapositions globales de sA et sB (Fig. 2b). Plus précisément, G83 2′-OH forme une liaison hydrogène directe avec l'oxygène phosphate du squelette C29. Néanmoins, nous n'avons pas observé d'écart significatif de l'hélice P2 par rapport à une hélice de forme A typique, y compris un élargissement du sillon principal, comme proposé précédemment sur la base des structures RMN du sous-domaine sB de RVB1441. Bien qu'il soit possible que les différences dans les largeurs de rainures principales pour les hélices CVB3 et RVB14 sB reflètent les différences dans les méthodologies utilisées pour ces déterminations de structure d'ARN58, les différences structurelles entre nos hélices CVB3 et RVB14 sB sont probablement dues au nombre différent de paires de bases. flanquant la jonction à 4 voies qui constituent l'hélice sB (Fig. 10 supplémentaire). L'hélice sB à neuf paires de bases dans le sous-domaine sB de CBV3 forme un tour hélicoïdal presque complet par rapport à un peu plus d'un demi-tour hélicoïdal formé par l'hélice sB à sept bases appariées dans le RVB14. De plus, par rapport à toutes les paires de bases canoniques du sB CVB3, l'hélice sB du RVB14 contient une paire G•U non canonique (Fig. 10 supplémentaire).

Les quatre paires de bases canoniques Watson-Crick impliquant les nucléotides G36 – C39 et G43 – C46 forment l'hélice P3 (Fig. 2a). Au sein de la jonction P2-P3, le G36-C46 de l'hélice P3 s'empile coaxialement sur le G34-C11 de l'hélice P2, formant presque une hélice continue en forme de A (Figs. 1c, 2a). Une boucle trinucléotidique L3 avec la séquence 5′-AUU-3′ ferme l'hélice P3, conformément aux résultats précédents de sondage biochimique et de SHAPE39,42,45. Dans la boucle (Fig. 2c), un virage serré dans l'hélice entre C39 et U41 projette bien le nucléotide A40 hors de l'axe hélicoïdal, permettant ses interactions tertiaires avec l'hélice P4. Le nucléotide U41 avec la conformation glycosidique C2'-endo syn s'empile sur la paire de bases C39-G43 fermant la boucle, ce qui le rend moins accessible aux modifications. Le deuxième virage serré entre U41 et G43 fait basculer le nucléotide U42 hors de l'axe hélicoïdal, établissant potentiellement des contacts cristallins avec un compagnon de symétrie Fab dans le réseau cristallin. Néanmoins, la faible densité électronique observée pour la nucléobase U42 avec un facteur B élevé suggère sa nature hautement dynamique. Ces caractéristiques structurelles observées pour cette triboucle correspondent aux résultats des sondages biochimiques précédents dans la solution selon laquelle les nucléobases U41 et U42 dans cette triboucle étaient respectivement modérément et fortement susceptibles d'être modifiées par CMCT39,45. De plus, bien que les triloops soient moins courants que les tétraboucles dans les structures d'ARN, la recherche de ce motif de triboucle dans les structures d'ARN rapportées précédemment à l'aide de la base de données d'ARN CoSSMos n'a abouti à aucun résultat pour une séquence 5′-AUU-3′ exacte dans les triloops. Cependant, la structure de cette triboucle 5′-ccAUUgg-3′ était superposable avec une triboucle 5′-ccUCUgg-3′ (Fig. 2d, RMSD = 0,44 Å) observée précédemment dans la structure cristalline d'Agrobacterium tRNALeu (code PDB : 5AH5 )60, suggérant que ces triboucles représentent une classe distincte de motifs d'ARN.

Les nucléotides C46 et G47 effectuent un virage serré dans la jonction P3-P4 et plient toute l'hélice P4, ce qui la positionne presque parallèlement à l'hélice P3 et permet un empilement coaxial avec l'hélice P1 (Figs. 1c, 2a). À côté de la jonction, les paires de bases G47 et C48 avec C80 et G79, respectivement, forment l'hélice P4a. Un clairon dinucléotidique asymétrique avec U49 et A50 sépare le P4a de l'hélice P4b, où U49 reste dans l'empilement hélicoïdal et implique la formation de bases triples U49•G51-C78 (Fig. 2a, e). Alors que G51 et C78 forment des paires de bases Watson-Crick, U49 et G51 interagissent via la liaison hydrogène Watson-Crick et Hoogsteen. De plus, U49 O4 crée une liaison hydrogène avec le groupe amino C78. Le nucléotide A50 se retourne hors de l'hélice et interagit avec une molécule Fab de symétrie dans le réseau cristallin, ce qui est peut-être crucial pour la cristallisation (Fig. 8 supplémentaire). De plus, le 2′OH de l'A50 se trouve à la distance de liaison hydrogène de son N3 et du G51 O4′. Conformément à la conservation élevée des nucléotides du renflement, ces caractéristiques structurelles semblent essentielles pour la stabilité de l'hélice sD. Alors que la structure cristalline peut représenter une conformation échantillonnée du renflement avec A50 inversé stabilisé par le contact cristallin, un réseau de liaisons hydrogène fort dans le renflement prend en charge une configuration stable plutôt que dynamique de ce renflement. De plus, le 49e nucléotide est moins conservé que A50 parmi les 5'CL entéroviraux, ce qui indique que l'A50 inversé peut être important pour les interactions avec les protéines de liaison 5'CL. Le renflement aide peut-être à préserver un positionnement correct de la région Py-Py pour les interactions tertiaires avec la boucle sC sans perturber l'axe hélicoïdal du sous-domaine sD. Après le renflement, les nucléotides C52 – A61 forment des paires de bases Watson-Crick avec U68 – G77, y compris les paires de bases Py-Py hautement conservées. Dans la région Py-Py, les nucléotides U55, C56 et U57 s'apparient avec U74, U73 et U72 via des liaisons hydrogène Watson-Crick non canoniques (Fig. 3a). Fait intéressant, la double hélice Py-Py est légèrement plus étroite (diamètre phosphate à phosphate = 16,8 ± 0,3 Å, Fig. 3b) par rapport aux doubles hélices flanquant la région (diamètre phosphate à phosphate = 18,6 ± 0,6 Å, Fig. 3b), ce qui est cohérent avec les observations précédentes dans les modèles RMN de CVB3 et RVB14 sDs36,37,38,40,43. Cependant, ces appariements de bases Py-Py consécutifs inhabituels (U55•U74, C56•U73 et U57•U72) n'ont créé aucune déformation significative dans le P4 à partir d'une hélice de forme A standard ou modifié les positions relatives des extrémités hélicoïdales (voir Fig. 11 supplémentaire pour plus de détails). Enfin, la boucle L4 avec une paire de bases de fermeture oscillante U62•G67, ​​qui suppose une structure de tétraboucle bien définie (Figs. 1c, 2a), coiffe l'hélice P4.

a La structure cristalline des paires de bases Py-Py dans l'hélice P4 de CVB3 5′CL2a. b La distance phosphate à phosphate entre les paires de bases à travers l'hélice P4. c Superposition de la structure cristalline sD du sous-domaine CVB3 5′CL2a (cyan) avec les structures RMN précédemment rapportées des sous-domaines sD pour CVB3 5′CL (bleu) et une séquence consensus entérovirale (magenta). d Superposition de la seule région Py-Py pour les trois structures comme décrit en (c). e La largeur de rainure principale dans l'hélice P4. Les lignes noires en pointillés représentent les distances entre Pi et Pi+6 à travers l'hélice. f La structure de tétraboucle de type GNRA observée dans la construction de cristallisation 5′CL2a. g La tétraboucle de type UNCG, telle qu'observée dans la structure RMN précédente du sous-domaine sD isolé de CVB3 5′CL38. Les lignes pointillées noires (a), (b) et (e) représentent les hétéroatomes dans les distances de liaison hydrogène. Le maillage gris en (c) et (d) représente le 2|Fo | - |Fc | carte de densité électronique au niveau de contour 1σ et rayon de découpe 1,8 Å.

Pour comparer les caractéristiques structurelles observées du sous-domaine sD avec les modèles RMN précédemment rapportés, nous avons superposé la structure cristalline du sous-domaine sD avec les modèles RMN précédents (structures à plus faible énergie) de sD pour CVB3 et une séquence consensus entérovirale (Fig. 3c, RMSD = 1,947 Å, et 3,461 Å, respectivement)37,38. Bien que nous ayons observé certaines différences dans les structures de renflement et de boucle L4, les structures de l'hélice Py-Py étaient très similaires (Fig. 3d, RMSD = 0, 430 Å et 1, 266 Å, respectivement). Fait intéressant, contrairement à notre structure cristalline, la structure sD consensus a montré U49 inversé et A50 empilé en hélice. Cette configuration permet la formation d'un réseau de liaisons H impliquant C48, U49, A50 et G77, incluant une base triple A50•C48-G77 au lieu de U49•G51-C78 observé dans la structure cristalline (Fig. 12 supplémentaire). Conformément à cette observation, des études antérieures utilisant des systèmes sans cellule ont montré qu'un seul renflement de nucléotide est suffisant pour la synthèse du brin (-)14,20. Chaque configuration peut exister, ou le pli de jonction global à quatre voies du CVB3 5′CL2a favorise la configuration de renflement observée dans la structure cristalline puisque le modèle RMN a été dérivé pour un sous-domaine sD isolé. Nous avons exclu le modèle CVB3 sD NMR pour cette comparaison car ce modèle incluait la séquence uniquement après le renflement. Ensuite, nous avons mesuré la largeur de la rainure principale dans l'hélice P4 (Fig. 3e). La distance moyenne mesurée entre le Pi (à partir de G47) et le Pi+6 à travers l'hélice P4 est de 11,5 ± 2,9 Å, ce qui est cohérent avec la largeur de rainure principale observée pour de nombreuses autres structures cristallines d'ARN (11,1 ± 2,2 Å)58. La largeur mesurée du sillon principal pour l'hélice P2 du sous-domaine B dans notre structure cristalline est également similaire à celle de l'hélice P4 (11,6 ± 1,4 Å), ce qui suggère que les hélices P2 et P4 ne présentent aucun écart significatif dans les largeurs du sillon principal. , qui contredit les revendications précédentes basées sur les modèles RMN des hélices sD et sB qui ont toutes deux un sillon principal élargi pour fournir des sites d'interaction pour la liaison protéique correspondante. La largeur moyenne des rainures principales pour les structures précédentes basées sur la RMN est de 15,7 ± 4,7 Å58, reflétant peut-être que les largeurs de rainures principales élargies suggérées pour les hélices sB et sD sont dues à certaines ambiguïtés associées à la modélisation RMN.

Des études biochimiques et RMN antérieures ont montré que la boucle sD est nécessaire et suffisante pour la liaison 3Cpro virale14,20,36,37,38. Étant donné que CVB3 3Cpro se lie de manière promiscuité avec les sous-domaines sD d'autres entérovirus avec tétraboucles mais ne se lie pas avec RVB14 sD avec une triloop20, ces études ont également suggéré que 3Cpro reconnaît la caractéristique structurelle globale dans la boucle sD plutôt qu'une séquence définie20,37,38. Cependant, aucune de ces études antérieures n'a examiné les conséquences de la mutation G66 hautement conservée sur la liaison 3Cpro. Notre structure CVB3 5′CL2a résolue à une résolution de 1,9 Å contient une mutation G66C. La construction avec la boucle sD de type sauvage a produit des cristaux, mais ils n'ont diffracté qu'à une résolution d'environ 8 Å, ce qui suggère que cette mutation était nécessaire pour une cristallisation robuste. Plus intéressant encore, cette mutation unique semble importante pour la conformation globale de la tétraboucle sD. Alors que la boucle L4, 5′-auCACCgu-3′, dans le sous-domaine sD de notre structure cristalline adopte un pli tétraboucle de type GNRA (N = n'importe quel nucléotide; R = A ou G) (Fig. 3f), des études RMN antérieures avec CVB3 Le sous-domaine sD et un consensus entéroviral ont montré que la boucle WT sD, 5′-auCACGgu-3′, adopte un pli tétraboucle de type UNCG (N = n'importe quel nucléotide) (Fig. 3g)36,37. Cela signifie que la séquence de la boucle sD, en particulier le quatrième nucléotide de la boucle, est également cruciale pour maintenir une conformation tétraboucle spécifique de la boucle sD, ce qui est cohérent avec la conservation élevée de G66 dans les 5'CL entéroviraux. En conséquence, il a été démontré que l'insertion de G en tant que quatrième nucléotide de la triboucle RVB14 sD pour former une tétraboucle restaure sa liaison à CVB3 3Cpro à un niveau similaire à celui de CVB3 5'CL20.

Pour comprendre la base structurelle de la liaison de 3Cpro avec le 5'CL et pour valider la pertinence fonctionnelle de notre structure cristalline, nous avons testé la liaison d'un CVB3 3Cpro recombinant avec nos constructions de cristallisation d'ARN. Sur la base d'études antérieures61, nous avons muté la cystéine catalytique (C147) du 3Cpro en alanine pour éviter son activité potentielle de protéase. Les tests ITC ont montré que CVB3 3Cpro lie les constructions WT et 5′CL2 avec des affinités similaires (Kd apparent = 1,40 ± 0,14 µM et 1,30 ± 0,09 µM, respectivement), suggérant que le greffage de la séquence de liaison Fab dans la boucle sB n'avait presque aucun effet sur la liaison 3Cpro avec la boucle sD (Fig. 4a, b; voir la Fig. 13 supplémentaire pour plus de détails). La construction 5′CL4 avec la boucle sD remplacée par la pentaloop de liaison Fab a montré une affinité beaucoup plus faible (Kd apparent = 9,4 ± 3,0 µM contre 1,40 ± 0,14 µM pour le 5′CL2), suggérant que le 3Cpro reconnaît spécifiquement la boucle sD dans le CVB3 5′CL (Fig. 4b; voir les détails supplémentaires de la Fig. 13). Remarquablement, par rapport à l'ARN 5′CL2, la construction de cristallisation 5′CL2a qui contenait une mutation G66C dans la boucle sD a montré une liaison beaucoup plus faible avec le 3Cpro (Kd apparent = 17,0 ± 8,0 µM, Fig. 4b; voir Fig. 13 supplémentaire pour plus de détails), suggérant un rôle critique de G66 dans la reconnaissance de la protéine 3Cpro. Cependant, le positionnement relatif de G66 dans le type UNCG et de C66 dans la tétraboucle de type GNRA est similaire (Figure 4 supplémentaire), ce qui indique que la conformation de la tétraboucle joue un rôle important dans la liaison de 3Cpro au-delà des interactions spécifiques à la séquence. Prises ensemble, ces analyses confirment que 3Cpro reconnaît une tétraboucle de type UNCG dans la boucle sD, et toute mutation qui provoque des altérations de cette structure abroge la liaison de 3Cpro avec les 5'CL entéroviraux.

a Profil ITC représentatif pour le WT 5′CL. La chaleur est dégagée lors des injections successives de 2 µl de CVB3 3C (~400 µM) à la solution d'ARN (~10 µM) dans la cellule de calorimétrie. b, c Les courbes de liaison des données ITC pour la liaison du 3C avec diverses constructions d'ARN de cristallisation (voir les Fig. 13, 14 et 15 supplémentaires pour plus de détails). d Structure du CVB3 5′CL2a, montrant les interactions tertiaires entre les sous-domaines sC et sD, en particulier l'amarrage de la boucle sC A40 dans la région Py-Py de l'hélice P4 dans le sous-domaine sD. e Les détails des interactions tertiaires de type A mineur entre la paire de bases A40 et C56•U73 dans la région Py-Py. f Un modèle de mutation A40U montrant une perturbation des interactions mineures A entre la boucle sC et l'hélice Py-Py. g Les courbes de liaison des données ITC pour la liaison du 3C avec le mutant A40U de la construction parente 5'CL2. Les lignes pointillées noires dans (d), (e) et (f) représentent des hétéroatomes dans les distances de liaison hydrogène. Le maillage gris en d et e représente le 2|Fo | - |Fc | carte de densité électronique au niveau de contour 1σ et rayon de découpe 1,8 Å.

Bien que les mutants de la boucle sD aient montré une affinité réduite pour 3Cpro, les affinités observables de ces mutants suggèrent des contacts supplémentaires de 3Cpro avec le 5'CL. Pour tester cette hypothèse, nous avons effectué des études de liaison 3Cpro avec le renflement dinucléotide et les mutants Py-Py. L'élimination du renflement des dinucléotides en ajoutant les nucléotides complémentaires (5′CL-sD-NB, Fig. 14 supplémentaire) a montré environ sept fois moins d'affinité (Kd apparent = 10,1 ± 2 µM, Fig. 4c) avec le 3Cpro par rapport au WT 5′CL (Kd apparent = 1,4 ± 0,14 µM, Fig. 14 supplémentaire), indiquant des contacts directs des nucléotides renflés avec le 3Cpro. Cependant, une construction (5′CL-sD-CN, Fig. 14 supplémentaire) avec la région Py-Py remplacée par les paires de bases canoniques affiche une affinité similaire (Kd apparente = 3,4 ± 0,7 µM, Fig. 4c) comme le WT 5 ′CL, soutenant que la région Py-Py est moins susceptible d'être impliquée directement dans la liaison 3Cpro. De plus, conformément aux rapports précédents20, un sous-domaine sD isolé (sDi, Fig. 15 supplémentaire) se lie à 3Cpro avec une affinité similaire (Kd apparent = 2,1 ± 0,12 µM, Fig. 4c) à celle du WT 5′CL intact, suggérant que le Le sous-domaine sD est suffisant pour la liaison de 3Cpro via des interactions spécifiques de la boucle sD et du renflement sD. De plus, des études de liaison 3Cpro avec des constructions sD isolées avec l'appariement canonique des bases U49A50 (sDi-NB, Kd apparent = 5 ± 0,1 µM), U49 uniquement (sDi-U49P, Kd apparent = 4,9 ± 0,87 µM) ou A50 uniquement (sDi-A50P, Kd apparent = 3, 5 ± 0, 6 µM) indiquent que la structure globale du renflement est essentielle pour la liaison de 3Cpro plutôt que l'identité du nucléotide renflé (voir la Fig. 15 supplémentaire pour les constructions et les données ITC). Ces résultats sont cohérents avec deux conformations différentes du renflement observées dans la précédente RMN37 et nos structures cristallines, et des études de réplication in vitro montrant la suppression des deux U49A50 mais pas U49 ou A50 ou l'échange de leurs positions a abrogé la synthèse du brin (-)14 ,20.

Notre structure cristalline du CVB3 5′CL pleine longueur a révélé des interactions tertiaires étendues entre les sous-domaines sC et sD, y compris des interactions sans précédent entre la boucle L3 et la région appariée basée sur l'hélice P4 Py-Py. Premièrement, les squelettes des hélices P3 et P4 interagissent via un réseau de liaisons hydrogène directes et médiées par l'eau (Fig. 4d). Les oxygènes phosphate G75 et U74 établissent des liaisons hydrogène directes avec les groupes 2′OH de G44 et C38, respectivement. Les oxygènes de phosphate G75 sont également impliqués dans la liaison hydrogène médiée par l'eau avec les groupes G44 N3, 2'OH et amino. Outre ces contacts entre les sous-domaines sC et sD, il est intéressant de noter que notre structure cristalline a révélé que la boucle L3 A40 s'arrime dans le sillon mineur de l'hélice Py-Py via les interactions de type A-mineur (Fig. 4e). L'A40 entre en contact avec le C56 et l'U73 via les interactions de liaison hydrogène Watson-Crick – Sugar-Edge et Hoogsteen – Sugar-Edge , formant un triplet de base A40 • C56 • U73. Plus précisément, les groupes 2′OH C56 et U73 interagissent avec les A40 N1 et N7, respectivement, et leurs O2 avec le groupe amino A40 par le biais de liaisons hydrogène directes (Fig. 4e). Pour valider cet amarrage de l'A40 en solution, nous avons mené des études RMN pour la construction 5'CL2. En appliquant différentes variantes des schémas de marquage A2RU6R (voir Méthodes), nous avons observé des signaux NOE (Nuclear Overhauser Effect) entre les A40 H2 et H1 de deux uraciles (Fig. 16 supplémentaire), ce qui est cohérent avec les interactions A40 et Py-Py dans notre structure cristalline, où les H1 'de U57 et U74 sont proches de H2 de A40 (<4 Å, Fig. 16 supplémentaire).

Les cations divalents tels que Mg2+ sont connus pour stabiliser les structures tertiaires de l'ARN. Néanmoins, la présence ou l'absence de Mg2+ dans la solution n'a pas modifié significativement les affinités de liaison de 3Cpro avec les constructions 5'CL (pour la 5'CL2, Kd apparent avec 10 mM Mg2+ = 1,4 ± 0,2 µM contre 1,30 ± 0,09 µM dans une solution dialysée de Mg2+), soutenant que les structures tertiaires à longue portée, comparées aux caractéristiques structurelles secondaires, dans le 5′CL peuvent n'avoir aucun effet majeur sur la liaison de 3Cpro. Notamment, les spectres RMN 1D et 2D de la construction CVB3 5'CL2a dans une solution avec 5 mM de Mg2+ et une solution dialysée de Mg2+ sont presque superposables (Fig. 17 supplémentaire). Seuls de petits déplacements chimiques dépendants du sel, mais aucun changement ou changement majeur dans l'intensité des pics dus à des changements structurels plus importants, sont observés, ce qui suggère que, contrairement au RVB14 5′CL20, le CVB3 5′CL se replie dans le type H compact Jonction 4 voies indépendante du Mg2+ dans la solution. Conformément aux résultats de RMN, nous n'avons observé aucun site de liaison Mg2+ proéminent dans la structure cristalline, même à une résolution de 1,9 Å, bien que la condition de cristallisation contienne au moins 10 mM de Mg2+.

Les interactions à longue portée entre les nucléotides A40 et Py-Py hautement conservés parmi les 5'CL entéroviraux suggèrent que ces nucléotides pourraient avoir des rôles importants pour la liaison de 3Cpro avec la structure 5'CL. Comme on pouvait s'y attendre, la mutation A40 ou Py-Py déstabiliserait la structure tertiaire 5′CL (voir Fig. 4f) et réduirait l'affinité de liaison de 3Cpro. Cependant, la mutation A40U dans la triboucle sC de CVB3 5′CL2 a eu peu d'effet sur la liaison de 5′CL avec 3Cpro (Kd apparent = 3,10 ± 0,22 µM comparé à Kd = 1,40 ± 0,14 µM pour le 5′CL2 (Fig. 4g ; Fig. 14 supplémentaire). Pourtant, cette légère diminution de l'affinité pour le mutant A40U peut être due à des changements conformationnels mineurs dans la structure 5'CL induits par cette mutation A40U (voir Fig. 4f). Ces résultats concordent également avec nos mesures ITC pour le 5′CL de type sauvage intact et un sous-domaine sD isolé pour la liaison 3Cpro (Kd apparent = 1,4 ± 0,14 µM et 2,10 ± 0,12 µM, respectivement; Fig. 4b, c, Fig. 13 et 15 supplémentaires), comme ainsi que les affinités rapportées précédemment de ces constructions d'ARN pour 3Cpro sur la base d'un test de liaison au filtre (Kd apparent = 2,7 et 4,6 µM, respectivement)20, soutenant que les interactions A40 n'ont aucun rôle direct dans la liaison du 3Cpro. le 5′CL de type sauvage et le 5′CL-sD-CN (le Py-Py remplacé par des paires canoniques) se construisent de manière similaire (Fig. 4c; Fig. supplémentaires. 14 et 15), conformément à l'observation précédente selon laquelle le remplacement de l'hélice Py-Py par des paires de bases canoniques n'a pas aboli la synthèse du brin (-)14. Cependant, comme le montre un test à trois hybrides de levure, la délétion de U74 a été supprimée, mais la mutation compensatoire C56U a conservé la liaison de 3Cpro avec le 5′CL20. En prenant ensemble nos résultats de liaison structurelle et 3Cpro, il est évident que l'intégrité du renflement dinucléotide et de la boucle qui préservent la structure globale du sous-domaine sD est nécessaire pour une liaison 3Cpro efficace, et les interactions tertiaires A40U-Py-Py ont des conséquences au-delà la reliure 3Cpro.

Nous avons émis l'hypothèse qu'un rôle structurel plus important de ces interactions est de stabiliser la jonction à 4 voies du 5′CL qui positionne le site de liaison 3Cpro (boucle sD) loin du site de liaison hôte PCBP (boucle sB) pour éviter les conflits stériques potentiels. entre 3Cpro et PCBP lors de l'assemblage des machines de réplication. Pour tester cette hypothèse, nous avons exprimé et purifié par recombinaison la protéine PCBP2 humaine pleine longueur et effectué les tests de liaison par électrophorèse sur gel (Fig. 18 supplémentaire). Comme il a été démontré que PCBP2 se lie à la fois à la boucle sB et à la région d'espacement riche en C entre le 5'CL et l'IRES, nous avons également effectué des tests de liaison avec les constructions d'ARN plus longues qui contiennent à la fois la région 5'CL et la région d'espacement. Conformément aux études précédentes selon lesquelles PCBP2 reconnaît la boucle sB, nous avons observé que le WT 5′CL mais pas le mutant de la boucle sB 5′CL2 se lie à PCBP2. Fait intéressant, le mutant A40U, qui n'a eu aucun effet sur la liaison de 3Cpro, interagit avec le PCBP2 avec beaucoup moins d'affinité par rapport au WT 5'CL, ce qui suggère que l'interaction A40-Py-Py a certains rôles dans la liaison de PCBP2 au 5'CL structure. De manière frappante, la construction d'ARN plus longue 5′CLWTSP avec la boucle sB et la séquence d'espacement lie étroitement le PCBP2 par rapport au 5′CL sans l'espaceur, indiquant que la boucle sB et la séquence d'espacement résident proches l'une de l'autre, ce qui est cohérent avec le juxtaposition observée des sous-domaines sA et sB dans notre structure cristalline. Bien que l'effet de l'interaction A40-Py-Py sur la liaison PCBP2 et la fonction 5′CL reste à étudier en profondeur, nos résultats préliminaires suggèrent que la structure 5′CL en forme de H a stabilisé cette juxtaposition de contact à longue portée A40-Py-Py. les sites de liaison PCBP2, la boucle sB et l'espaceur bien séparés du site de liaison 3Cpro, le sous-domaine sD.

Pour étudier la pertinence structurelle des nucléotides au sein des 5'CL entéroviraux, nous avons effectué une analyse phylogénétique à l'aide d'outils bioinformatiques. L'alignement de plus de 5000 séquences de génomes d'entérovirus montre un degré élevé de conservation des séquences dans la région 5'CLs (Fig. 19 supplémentaire). La structure secondaire consensuelle calculée (Fig. 5a; Fig. 20 supplémentaire) à partir de ces alignements de séquences pour sept génotypes d'entérovirus à l'aide de R-Scape62 indique que les caractéristiques structurelles de chaque sous-domaine sA, sB, sC et sD sont hautement conservées, conformément à la structure secondaire consensuelle précédemment proposée du 5′CL entéroviral dans la base de données Rfam63 obtenue en alignant 162 séquences de 87 espèces d'entérovirus seulement. Notamment, les nucléotides clés observés dans notre structure cristalline CVB3 5'CL, y compris le renflement A40, Py-Py et sD, sont absolument conservés, suggérant l'exigence virale de maintenir ces nucléotides contre une forte pression de sélection. Fait intéressant, la structure secondaire consensuelle optimisée R-scape62 prédit le sous-domaine sC comme une hélice à quatre paires de bases fermée par une triboucle avec l'A40 absolument conservé comme troisième nucléotide dans la triboucle. De même, le sous-domaine sD contient une hélice de 6 paires de bases hautement conservée entre la jonction à quatre voies et la région à paires de bases Py-Py. L'hélice est également interrompue par un renflement de deux nt entre les 2e et 3e paires de bases suivant la jonction à quatre voies. La conservation de la longueur et de la structure secondaire dans les sous-domaines sC et sD (Fig. 21 supplémentaire) avec cet arrangement spécifique est peut-être nécessaire pour maintenir les interactions spécifiques entre la boucle L3 et la région appariée basée sur Py-Py, cohérentes avec les interactions tertiaires observées. dans notre structure cristalline.

a Modèle structurel secondaire proposé de consensus entéroviral 5′CL (voir également la Fig. 20 supplémentaire pour plus de détails). Les 5′CL sont l'un des éléments d'ARN les plus conservés parmi les entérovirus (b) Le pli consensuel tridimensionnel des 5′CL dans les génomes entéroviraux basé sur la structure cristalline de CVB3 5′CL montrant les modes de liaison du 3CD viral et du PCBP hôte protéines. Les lignes pointillées rouges représentent les interactions tertiaires et illustrent l'empilement coaxial des sous-domaines correspondants.

Il existe deux étapes distinctes dans la réplication du génome entéroviral. La première est la synthèse d'ARN à brin (-) en utilisant l'ARN génomique comme matrice, et la seconde est la synthèse en retour de l'ARN génomique à brin (+) en utilisant l'ARN à brin (-) nouvellement fabriqué comme matrice. Le 5′CL est l'un des composants majeurs de la machinerie de réplication du génome entéroviral qui lie directement les facteurs protéiques viraux et cellulaires pour former un complexe RNP compétent pour la réplication. Le sous-domaine sD de 5'CL interagit avec la protéine de fusion virale 3CD via son 3Cpro qui amène la polymérase virale Dpol au site d'initiation de la réplication. Le sous-domaine sB se lie à PCBP2, qui interagit ensuite avec le complexe de queue PABP-poly(A) à l'extrémité 3' pour circulariser le génome viral. Le 3CD interagit également avec cre, un domaine d'ARN tige-boucle situé dans la région codante 2C, pour favoriser l'uridylation de la protéine virale VPg. Le VPg-pUpU résultant sert alors d'amorce pour la synthèse d'ARN à brin (-) par la polymérase Dpol active, un produit d'autoclivage du précurseur 3CD. De plus, la séquence d'ARN conservée et les caractéristiques structurelles de la 5′CL influencent l'uridylation du VPg et la stabilité du génome viral et peuvent faciliter la machinerie de réplication pour reconnaître le génome entéroviral dans un milieu de myriade d'ARN cellulaires64. Par conséquent, les structures à haute résolution des 5'CL et les complexes RNP correspondants avec 3C ou 3CD et PCPB fournissent des informations importantes non seulement pour une compréhension détaillée des mécanismes de réplication du génome entéroviral - un processus virologique mal compris - mais aussi pour le développement de médicaments. qui ciblent cette plateforme. Bien que les approches virologiques, de biologie moléculaire, biochimiques et biophysiques précédentes aient facilité une certaine compréhension structurelle et fonctionnelle des 5′CL pour initier la réplication du génome entéroviral et comment leurs sous-domaines interagissent avec les protéines 3C ou 3CD et PCPB au niveau moléculaire36,37,38, 39,40,41,42,43,44, notre structure cristalline CVB3 5′CL représente la première structure à haute résolution d'un 5′CL intact de n'importe quel entérovirus, jetant les bases d'une enquête plus approfondie sur le 5′CL médié mécanismes de réplication des entérovirus.

Les structures secondaires globales des 5′CL CVB3 et RVB14, y compris les modèles dérivés de la RMN pour les sous-domaines sC et sD isolés, sont presque identiques. Cependant, l'architecture tridimensionnelle de notre structure cristalline CVB3 5′CL diffère considérablement de celle des modèles RVB14 5′CL. Contrairement au modèle RVB14 5′CL43, notre structure cristalline adopte une jonction à 4 voies de type H avec les sous-domaines sA-sD et sB-sD empilés coaxialement, juxtaposant sA avec sB et sC avec sD. Ces écarts sont peut-être liés à la faible résolution de la technique SAXS et à la modélisation informatique de la structure 5′CL intacte basée sur les structures RMN des sous-domaines sB et sD isolés uniquement sans tenir compte des structures des sous-domaines sA et sC. De plus, en utilisant les approches RMN et SAXS, Warden et al. 43 ont précédemment proposé les modèles structurels dépendants du Mg2+ pour le RVB14 5′CL pleine longueur. Sans le Mg2 +, le RVB14 5'CL a pris une conformation étendue similaire à une jonction à 4 voies de type cK avec les sous-domaines sB et sD résidant presque perpendiculairement l'un à l'autre, mais avec le Mg2 +, le même ARN replié dans une conformation plus compacte qui juxtaposent les sous-domaines sB et sD. De plus, RVB14 5'CL a présenté un changement substantiel des déplacements chimiques RMN pour les nucléotides impliqués dans l'hélice Py-Py lors de l'ajout du Mg2 + 43, ce qui n'était pas cohérent avec celui observé pour le même sous-domaine sD isolé40. Cependant, ces observations sont cohérentes avec la stabilisation de la région Py-Py par des interactions tertiaires avec la boucle L2, comme observé dans notre structure cristalline CVB3 5'CL intacte. Bien que les conformations dépendantes du Mg2+ de divers 5′CL entéroviraux n'aient pas encore été étudiées en détail, contrairement aux résultats précédents avec RVB14, nos résultats préliminaires de RMN confirment que le CVB3 5′CL se replie en une structure de jonction compacte à 4 voies de type H indépendante du Mg2+. dans la solution, suggérant les différents rôles de Mg2+ dans la stabilisation de différents 5'CL entéroviraux.

Des études antérieures ont montré que l'efficacité de la réplication du génome entéroviral dépend des sites d'interaction entre le PCBP et les protéines 3C ou 3CD au sein de la structure 5′CL. Le sous-domaine sD est requis et suffisant pour la liaison 3C. Par conséquent, le renflement, la région Py-Py et les structures de tétraboucle sont les régions les plus conservées du sous-domaine sD qui influencent de manière significative la synthèse d'ARN à brin (+) et (-). Pour CVB3, la suppression du renflement du dinucléotide U49A50 a inhibé la synthèse du brin (-), mais les mutations A49U50 pour échanger ces positions de nucléotides et la suppression du nucléotide U49 ou A50 n'ont eu presque aucun effet, suggérant qu'un seul renflement de nucléotide est suffisant pour le ( -)-synthèse de brin. Cependant, la synthèse du brin (+) nécessitait un renflement de dinucléotide intact. Alors que la suppression de l'U74 dans l'hélice Py-Py a aboli la liaison 3C avec le 5′CL, les données RMN précédentes ne supportaient pas les interactions directes de la protéine avec les nucléotides dans la région Py-Py. Cependant, le remplacement du C56•U73 par la paire U56•U73 a préservé la liaison 3C avec le 5′CL. D'autres études utilisant des tests acellulaires pour PV et CVB3 ont montré que l'élimination complète du mésappariement Py-Py avec les paires de bases Watson-Crick augmentait la synthèse du brin (-) tout en diminuant la synthèse du brin (+), suggérant que le Py-Py La région dans le sous-domaine sD est essentielle pour maintenir le rapport des brins d'ARN (-) et (+) pendant l'infection virale. Structurellement, la région Py-Py maintient une hélicité de forme A, toute mutation qui ne modifie pas l'hélicité de forme A permettrait toujours les interactions de type A-mineur entre la boucle sC et la région Py-Py, mais un scénario similaire est moins probablement dans une structure analogue à l'extrémité 3' du brin (-). Peut-être que l'exigence de la région Py-Py dans le 5′CL est plus importante dans la synthèse du brin (+) à l'aide d'une matrice d'ARN à brin (-). Il n'entre pas dans le cadre de cette étude d'étudier les structures des structures d'ARN analogues formées à l'extrémité 3′ de l'ARN du brin (-), mais notre structure cristalline soutient que la région Py-Py stabilise la structure globale 5′CL via des interactions tertiaires avec la boucle sC. En outre, le sous-domaine sD isolé présente une affinité de liaison similaire à celle du CVB3 5′CL intact, ce qui suggère que les caractéristiques structurelles absolument conservées dans le sous-domaine sD parmi les entérovirus sont importantes au-delà de la liaison de la protéine 3C. De plus, bien que les effets des mutations de la boucle sC, y compris l'A40, dans la synthèse des brins (-) et (+) restent à étudier, la conservation absolue de l'A40 contre une pression de sélection intense souligne son exigence de maintenir l'intégrité de ces derniers. interactions tertiaires pour la réplication du génome viral.

Une comparaison de notre structure CVB3 5′CL avec d'autres entérovirus et rhinovirus suggère que les longueurs de l'hélice P3 (quatre paires de bases) et de l'hélice P4 précédant la région Py-Py (six paires de bases interrompues par le renflement du dinucléotide) sont les éléments structuraux les plus conservés. Ces caractéristiques soulignent une exigence spécifique pour le positionnement des paires A40 et Py-Py afin de faciliter les interactions tertiaires entre les sous-domaines sC et sD. Ces interactions tertiaires au sein du 5′CL sont plus prononcées lorsque l'on considère les sites de liaison au PCBP. Au sein de la 5'CL entérovirale, le PCBP interagit avec la boucle sB et une séquence d'espacement riche en C à l'extrémité de la structure 5'CL, la dernière séquence contribuant davantage aux interactions de liaison. Les mutations des séquences riches en C dans le sous-domaine B et la région d'espacement abolissent la liaison du PCBP et détériorent la synthèse d'ARN du brin (-), soutenant que la liaison du PCBP dans ces régions est essentielle pour une réplication efficace du génome entéroviral19,27,28. Contrairement aux modèles précédemment proposés de RVB14 5'CL avec la juxtaposition des sous-domaines sD et sB, notre structure cristalline de CVB3 5'CL a révélé la juxtaposition des sous-domaines sA et sB, rapprochant la boucle sB et la séquence d'espacement riche en C. (Fig. 5b), ce qui est cohérent avec nos études de liaison préliminaires avec le PCBP2 humain et corrobore ces observations biochimiques précédentes. Par conséquent, les interactions tertiaires entre la boucle sC et les régions Py-Py jouent un rôle important dans la stabilisation de la structure 5'CL et le positionnement précis des boucles sB et sD, fournissant une plate-forme prête à l'emploi pour les composants de réplication à lier plutôt qu'en implication directe. de ces sous-structures avec les interactions 5′CL-protéine. Cependant, d'autres études pour déterminer les structures à haute résolution des 5'CL entéroviraux en complexe avec la protéine virale correspondante 3C ou 3CD et la protéine hôte PCPB2 définiront des étapes critiques vers une compréhension mécanistique de la réplication entérovirale et le développement de thérapies potentielles ciblant cette plateforme de réplication entérovirale. .

Des constructions d'ARN pour la cristallisation, la liaison aux protéines et les études de RMN ont été synthétisées par transcription in vitro. La matrice d'ADN avec une séquence promotrice T7 pour la réaction de transcription a été produite par amplification PCR d'ADNsb acheté auprès d'Integrated DNA Technologies. Les deux premiers nucléotides de l'amorce inverse ont été modifiés en 2'-OMe pour réduire l'hétérogénéité de l'extrémité 3' du transcrit65. L'ARN a été transcrit pendant 3 h à 37 ° C dans un tampon contenant 40 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM de spermidine, 10 mM de NaCl, 25 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 40 U/ml d'inhibiteur de RNase, 5 U/ml TIPPase, 5 mM de chaque NTP, 50 pmol/ml de matrice d'ADN et 50 μg/ml d'ARN polymérase T7 maison66. La réaction de transcription a été désactivée en ajoutant 10 U/ml de DNase I (Promega) et en incubant à 37 °C pendant 1 h. Pour synthétiser des échantillons RMN, l'ARN a été transcrit en utilisant les NTP marqués achetés auprès de Cambridge Isotope Laboratories. L'ARN a été transcrit pendant 8 h et la réaction a été désactivée avec de l'urée 500 mM et de l'EDTA 60 mM, puis le mélange a été bouilli pendant 5 min. Tous les échantillons d'ARN ont été purifiés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (dPAGE). La bande a été visualisée par ombrage UV, excisée du gel et éluée pendant une nuit à 4 ° C dans Tris 10 mM, pH 8, 0, EDTA 2 mM et NaCl 300 mM. Le tampon d'ARN élué a été échangé trois fois avec de l'eau pure en utilisant une colonne Amicon de coupure de 10 kDa (Millipore Sigma). L'ARN a été collecté, aliquoté en fractions de 300 μl et stocké à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure. Pour les échantillons RMN, l'ARN a été purifié davantage par précipitation à l'éthanol avant d'être lyophilisé et le tampon échangé pour les mesures RMN.

Le plasmide d'expression Fab BL3-6 était un aimable cadeau de Joseph Piccirilli, de l'Université de Chicago. Le Fab a été purifié selon les protocoles publiés52,67,68. En bref, le plasmide a été transformé dans 55244 cellules compétentes d'E. coli et strié dans une plaque de gélose LB avec 100 ug/ml de carbénicilline. Plusieurs colonies ont été sélectionnées pour inoculer une culture starter de 15 ml et cultivées à 30 ° C pendant 8 h. La culture starter a ensuite été utilisée pour inoculer 1 litre de milieu 2xYT et les cellules ont été cultivées pendant 24 h à 30 ° C. Pour la surexpression de Fab, les cellules ont été centrifugées à 22 ° C et 6000 × g pendant 10 min, remises en suspension dans un milieu appauvri en phosphate de 1 litre et cultivées pendant 24 h à 30 ° C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 4 ° C et 6000 × g pendant 10 min, remises en suspension dans du PBS, tampon pH 7,4 avec 0,01 mg / ml de pancréas bovin DNase I (Sigma-Aldrich) et 400 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), et lysé par sonication (Qsonica, Cole-Parmer). Le mélange a d'abord été centrifugé à 40 000 × g, le lysat clair a été filtré à travers un filtre de 0,45 micron (VWR) et le Fab a été purifié à l'aide du système de chromatographie liquide protéique rapide Bio-Rad NGC (FPLC). Tout d'abord, le lysat a été passé à travers une colonne de protéine A Hi-trap (Cytiva) et le Fab capturé a été élué avec de l'acide acétique 0, 1 M. Les fractions ont été collectées, diluées 10x avec du PBS, tampon pH 7,4, et chargées dans une colonne de protéine G Hi-trap (Cytiva). Les fractions Fab éluées de la colonne de protéine G dans de la glycine 0, 1 M, pH 2, 7, ont été collectées, diluées 10x avec un tampon NaOAc 50 mM, NaCl 50 mM, pH 5, 5 et chargées dans une colonne d'héparine Hi-trap (Cytiva). Enfin, les fractions Fab éluées de la colonne d'héparine par l'élution en gradient en utilisant du tampon NaOAc 50 mM, NaCl 2 M, pH 5,5 ont été collectées et le tampon a été échangé 3x avec du PBS 1x pH 7,4 en utilisant une colonne Amicon de coupure de 30 kDa (Millipore Sigma) . Le Fab concentré a été collecté, analysé par SDS-PAGE à 12 % et testé pour l'activité RNase à l'aide du kit RNaseAlert (Ambion, www.thermofisher.com). Des aliquotes (~ 300 μl) de Fab purifié ont été stockées à -80 ° C.

L'ARN dans l'eau (~ 100 ng) a été replié dans un tampon contenant du Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, du MgCl2 10 mM et du NaCl 100 mM. L'ARN a été chauffé à 90 ° C pendant 1 min, et un volume approprié de tampon de repliement 10x a été ajouté, suivi d'une incubation à 50 ° C pendant 10 min, puis dans de la glace pendant 5 min. L'ARN replié a ensuite été incubé pendant 30 min à température ambiante avec différents équivalents de protéine Fab ou 3C. Les échantillons de complexe protéine-ARN ont été mélangés avec un volume approprié de solution de chargement de gel d'agarose natif 6x contenant 30 % de glycérol, 0,1 % chacun de bleu de bromophénol et de xylène cyanol. Ces échantillons ont été chargés sur des gels de polyacrylamide natif à 10 % et exécutés à 115 V dans un tampon TBE 0,5 x pré-refroidi (base Tris 50 mM, acide borique 50 mM et EDTA 1 mM, pH 7,5) à 4 °C. Les gels ont été colorés avec du bromure d'éthidium et imagés à l'aide du système de documentation de gel Azure 200 (Azure Biosystems).

L'échantillon d'ARN a été replié dans un tampon de repliement contenant 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM de MgCl2 et 100 mM de NaCl. Tout d'abord, l'ARN dans l'eau a été chauffé à 90 ° C pendant 1 min, et un volume approprié de tampon de repliement 10x a été ajouté, suivi d'une incubation à 50 ° C pendant 10 min et dans de la glace pendant 5 min. L'ARN replié a ensuite été incubé pendant 30 min à température ambiante avec 1,1 équivalent de Fab et concentré à 6 mg mL-1 en utilisant un seuil de coupure de 10 kDa, colonne Amicon Ultra-1 (Millipore Sigma). Ensuite, les complexes Fab-ARN ont été passés à travers des filtres centrifuges Millipore à coupure de 0, 2 μm (www.emdmillipore.com). Le robot de manipulation de liquide Xtal3 Mosquito (TTP Labtech, ttplabtech.com) a été utilisé pour mettre en place des écrans de cristallisation à diffusion de vapeur en suspension à RT à l'aide de kits de dépistage disponibles dans le commerce de Hampton Research et Jena Bioscience. Les cristaux se sont formés en une semaine dans diverses conditions. Certaines conditions ont été optimisées pour le pH, le précipitant et la concentration en sel afin de faire croître des cristaux plus gros en utilisant la méthode de diffusion de vapeur en goutte suspendue. Les cristaux ont atteint leur taille maximale en une semaine. Pour la cryoprotection, des gouttes contenant des cristaux adaptés ont été portées à 30% de glycérol sans changer les autres compositions. Les cristaux ont été immédiatement congelés instantanément dans de l'azote liquide après avoir été extraits des gouttes et transportés au Laboratoire national d'Argonne pour recueillir les données de diffraction des rayons X.

Les ensembles de données de diffraction des rayons X ont été collectés sur les lignes de lumière de la section Advanced Photon Source NE-CAT 24-ID-C et 24-ID-E. Tous les ensembles de données ont ensuite été intégrés et mis à l'échelle à l'aide de ses programmes automatisés RAPD sur site (https://rapd.nec.aps.anl.gov/rapd/). Les phases initiales ont été obtenues par remplacement moléculaire avec la structure précédemment rapportée de Fab BL3-6 (PDB : 6B14 comme modèle de recherche à l'aide de Phaser sur Phenix69. La construction et l'affinement du modèle itératif ont été effectués à l'aide de COOT70 et du package Phenix69. L'ARN a été construit sans ambiguïté par modélisation des nucléotides individuels dans la carte de densité électronique obtenue à partir du remplacement moléculaire. Au cours de l'affinement, les options NCS par défaut et les paramètres TLS sélectionnés automatiquement dans Phenix ont été utilisés. La plupart des molécules d'eau ont été automatiquement déterminées par le logiciel Phenix lors des raffinements. Cependant, certaines molécules d'eau ont été ajoutés manuellement pour la densité électronique positive dans la carte en fonction de leur possibilité de former des liaisons hydrogène avec des résidus de protéines ou d'ARN La surface accessible au solvant et la zone d'interaction ont été calculées à l'aide de (http://www.ebi.ac.uk/ pdbe/pisa/) 57. Les figures liées à la structure ont été créées dans PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC) et les étiquettes des figures ont été éditées dans CorelDraw (Corel Corporation, http://www.corel.com) .

Le CVB3 3Cpro recombinant a été exprimé et purifié en utilisant les protocoles décrits précédemment avec quelques modifications20,38,61. La séquence d'ADN optimisée en codons codant pour le mutant CVB3 3Cpro C147A a été clonée dans le vecteur pET-22b(+) entre les sites de restriction NdeI et XhoI (GenScript, https://www.genscript.com). La protéine exprimée contenait la séquence MGPAFEFAVA MMKRNSSTVK TEYGEFTMLG IYDRWAVLPR HAKPGPTILM NDQEVGVLDA KELVDKDGTN LELTLLKLNR NEKFRDIRGF LAKEEVEVNE AVLAINTSKF PNMYIPVGQV TEYGFLNLGG TPTKRMLMYN FPTRAGQAGG VLMSTGKVLG IHVGGNGHQG FSAALLKHYF NDEQ avec le vecteur codé 6x-His tag au C-terminal. Le plasmide d'expression a été transformé en BL21 (DE3) E. coli et les cellules ont été cultivées dans un milieu 2xYT additionné de 100 μg/mL de carbénicilline à 37 °C sous agitation à 220 tr/min jusqu'à une DO d'environ 0,6. Les cellules ont ensuite été induites pour l'expression des protéines en utilisant de l'IPTG (isopropylthio-β-galactoside) à la concentration finale de 0, 5 mM, cultivées pendant 6 heures à 25 ° C et enfin, récoltées par centrifugation à 6 000 x g. La purification des protéines a été réalisée dans un système Bio-Rad FPLC. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans un tampon de lyse contenant 50 mM de Tris HCl, pH 7,5, 300 mM de NaCl et 5 mM d'imidazole et lysé par sonication. Le lysat a été centrifugé à 40 000 × g à 4 ° C et le surnageant a été passé à travers un filtre de 0,45 micron. Le lysat clarifié a ensuite été appliqué sur une colonne HisTrap™ (Cytiva) et la protéine a été éluée de la colonne avec un tampon (Tris HCl 50 mM, NaCl 300 mM et imidazole 250 mM, pH 7,5) après avoir lavé la colonne avec 5 volumes de colonne du tampon de lyse. Les fractions éluées ont été recueillies, dialysées contre un tampon contenant du Tris HCl 50 mM, du KCl 100 mM, de l'EDTA 1 mM et du glycérol à 5 ​​%, pH 7,5, puis purifiées par chromatographie d'exclusion stérique (HiLoad® 26/600 Superdex® 200 pg colonne, Cytiva). Les fractions protéiques à pic unique ont été regroupées et concentrées à l'aide des filtres centrifuges Amicon (seuil de poids moléculaire 10 kDa, Millipore Sigma), congelées avec du N2 liquide en petites aliquotes et stockées à -80 ° C.

La PCBP2 humaine pleine longueur (résidus 11 à 359) avec l'étiquette 6x-His C-terminale a été exprimée et purifiée en utilisant les protocoles décrits précédemment avec quelques modifications. En bref, la séquence d'ADN optimisée en codons codant pour la protéine PCBP2 humaine a été clonée dans le vecteur pET-22b(+) entre les sites de restriction NdeI et XhoI (GenScript, https://www.genscript.com). L'expression et la purification ont été effectuées en utilisant une procédure similaire à celle décrite ci-dessus pour 3Cpro. Le tampon de lyse contenait du Tris 50 mM (pH 7,5), du NaCl 300 mM et de l'imidazole 20 mM, tandis que le tampon d'élution de la colonne HisTrap contenait du Tris 50 mM (pH 7,5), du NaCl 300 mM et de l'imidazole 250 mM. Les fractions éluées ont été recueillies, dialysées contre un tampon contenant du Tris 50 mM (pH 7,5), du KCl 100 mM, de l'EDTA 1 mM et du glycérol à 5 ​​%, puis purifiées par chromatographie d'exclusion stérique avec HiLoad® 26/600 Superdex® 75 pg colonne. Les fractions protéiques à pic unique ont été regroupées et concentrées à l'aide des filtres centrifuges Amicon (seuil de poids moléculaire 30 kDa), congelées avec du N2 liquide en petites aliquotes et stockées à -80 ° C jusqu'à une utilisation ultérieure.

Les expériences de calorimétrie de titrage isotherme (ITC) ont été réalisées dans l'équipement MicroCal PEAQ-ITC Automated (Malvern Panalytical) en utilisant des échantillons d'ARN et de protéines fraîchement préparés. Les échantillons d'ARN et de protéines ont été dialysés pendant une nuit dans un tampon contenant 50 mM de Tris HCl, pH 7,5, 100 mM de KCl, 1 mM d'EDTA et 5 % de glycérol. La seringue d'injection contenait 150 μl de protéine 3Cpro ~ 400 μM et la cellule de calorimétrie était chargée avec 500 μl d'ARN ~ 10 μM. Après équilibrage thermique à 25 ° C et un délai initial de 60 secondes, une seule injection de 200 nl suivie de 19 injections en série de 2 μl de protéine 3Cpro a été réalisée dans la cellule de calorimétrie. Le Kd rapporté pour chaque construction d'ARN représente la moyenne ± écart-type obtenu à partir des expériences en triple.

Les échantillons d'ARN ont été mesurés dans 100 % de D2O (99,8 %, Cambridge Isotope Laboratories) avec 20 mM de phosphate de sodium, pH 7,4, 70 mM de KCl, 5 mM de NaCl et 5 mM de MgCl2 (sauf indication contraire) dans un tube de 5 ml à des concentrations variant de 0,7 à 1,2 mM. Les données ont été recueillies avec un spectromètre Bruker AVANCE (600 MHz, 1H) à 308 K avec un schéma d'échantillonnage pondéré72. Les affectations 1H non échangeables ont été obtenues à partir des données NOESY 2D (temps de mélange NOE = 300 ms, délai de relaxation = 12,0 s, T = 308 K). Toutes les données RMN ont été traitées avec NMRFX73 et analysées avec NMRViewJ74. Des attributions partielles ont été effectuées à l'aide de la stratégie d'attribution séquentielle standard basée sur NOE75,76 sur des échantillons d'ARN marqués A2RUR, U6R et A2R en suivant les stratégies qui ont été mises au point dans des études antérieures77. Les affectations ont été validées par des comparaisons avec les valeurs de déplacement chimique dans le référentiel RMN BioMagResBank à l'aide de NMRViewJ78,79,80. De plus, les affectations précédentes ont été utilisées pour transférer et contre-valider certaines de nos affectations36,37.

Sauf indication contraire, les expériences associées à la PAGE native, à la SDS PAGE et à l'ITC ont été réalisées en triple exemplaire. Chaque réplique a produit des résultats similaires.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les coordonnées atomiques et les facteurs de structure pour la structure cristalline rapportée ont été déposés auprès de la Protein Data Bank sous le code d'accession 8DP3. Les auteurs fourniront les données brutes, des informations supplémentaires et des matériaux, y compris le plasmide pour l'expression de Fab BL3-6, sur demande. Les demandes doivent être adressées à DK

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Ce travail a été soutenu par des prix de démarrage, SURFF et START de l'Université du Maryland du comté de Baltimore et le prix NSF CAREER 2236996 à DK et en partie par la subvention NIH T32 GM066706 à NKD Le travail cristallographique est basé sur des recherches menées au Northeastern Lignes de lumière de l'équipe d'accès collaboratif (24-ID-C et 24-ID-E), financées par l'Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health (P30 GM124165). Le détecteur Eiger 16 M sur 24-ID-E est financé par une subvention NIH-ORIP HEI (S10OD021527). Cette recherche a utilisé les ressources Advanced Photon Source - une installation utilisateur du bureau des sciences du département américain de l'énergie (DOE) exploitée pour le bureau des sciences du DOE par le laboratoire national d'Argonne sous le contrat n ° DE-AC02-06CH11357. Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l'Advanced Photon Source du Laboratoire national d'Argonne pour avoir fourni des conseils techniques lors de la collecte de données. Nous sommes reconnaissants au professeur Michael Summers, de l'Université du Maryland du comté de Baltimore, pour avoir aimablement fourni les installations de RMN et d'ITC et pour les commentaires constructifs sur le manuscrit.

Département de chimie et de biochimie, Université du Maryland Baltimore County, Baltimore, MD, 21250, États-Unis

Naba K. Das, Nele M. Hollmann, Jeff Vogt, Hasan A. Banna, Manju Ojha et Deepak Koirala

Howard Hughes Medical Institute, Université du Maryland Baltimore County, Baltimore, MD, 21250, États-Unis

Nele M. Hollmann

Département de biochimie et de biologie moléculaire, École de médecine de l'Université du Maryland, Baltimore, MD, 21201, États-Unis

Spiridon E. Sevdalis

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NKD et DK ont conçu et conçu les expériences. NKD a préparé les échantillons, mené la plupart des expériences et résolu les structures cristallines avec l'aide de DKNMH, collecté et analysé les données RMN. JV a effectué tous les travaux de bioinformatique et de calcul. SS a conçu et mis en place les premiers essais de cristallisation. HAB et MO ont aidé NKD avec des expériences biochimiques et la collecte de données de diffraction des rayons X. NKD a analysé la plupart des données biochimiques et cristallographiques et a interprété les résultats avec DKNKD et DK a écrit le manuscrit, et tous les auteurs ont revu le manuscrit de manière critique.

Correspondance à Deepak Koirala.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Benjamin Akiyama et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Das, NK, Hollmann, NM, Vogt, J. et al. Structure cristalline d'un élément de réplication d'ARN de trèfle 5 'entéroviral hautement conservé. Nat Commun 14, 1955 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37658-8

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Reçu : 28 juillet 2022

Accepté : 23 mars 2023

Publié: 07 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37658-8

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