Les structures cristallines révèlent les mécanismes catalytiques et régulateurs du double

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4880 (2022) Citer cet article

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L'enzyme E1 Uba6 initie la transduction du signal en activant l'ubiquitine et la protéine de type ubiquitine FAT10 dans un processus en deux étapes impliquant une catalyse séquentielle de l'adénylation et de la formation de liaisons thioester. Pour obtenir des informations mécanistes sur ces processus, nous avons déterminé la structure cristalline d'un complexe humain Uba6/ubiquitine. Deux architectures distinctes du complexe sont observées : une dans laquelle Uba6 adopte une conformation ouverte avec le site actif configuré pour la catalyse de l'adénylation, et une seconde conformation fermée radicalement différente dans laquelle le site actif d'adénylation est désassemblé et reconfiguré pour la catalyse de la formation de liaisons thioester. . Étonnamment, une molécule d'inositol hexakisphosphate (InsP6) se lie à un site allostérique précédemment non identifié sur Uba6. Nos données structurelles, biochimiques et biophysiques indiquent que InsP6 inhibe allostériquement l'activité d'Uba6 en modifiant l'interconversion des conformations ouvertes et fermées d'Uba6 tout en améliorant sa stabilité. En plus de révéler les mécanismes moléculaires de la catalyse par Uba6 et de la régulation allostérique de ses activités, nos structures fournissent un cadre pour le développement d'inhibiteurs spécifiques d'Uba6 et soulèvent la possibilité d'une régulation allostérique d'autres E1 par des métabolites cellulaires naturels.

La modification post-traductionnelle (PTM) des protéines par l'ubiquitine (Ub) et les protéines de type Ub (Ubls) sous-tend la régulation des processus cellulaires fondamentaux, notamment le contrôle du cycle cellulaire, la réparation de l'ADN, la transduction du signal et l'immunité1. La conjugaison Ub/Ubl nécessite les interactions séquentielles et les activités de cascades parallèles d'enzymes comprenant E1, E2 et le plus souvent E3, qui ensemble activent, font la navette et ligaturent Ub/Ubl aux protéines cibles2. Les deux Ub E1 humains, Uba1 et Uba6, fonctionnent comme des gardiens de la cascade de conjugaison Ub en couplant l'hydrolyse de l'ATP (adénylation) avec la formation d'une liaison thioester E1-Ub à haute énergie (thiolation). Ceci est ensuite suivi par le transfert d'Ub activé vers des répertoires distincts d'enzymes E2 apparentées (transthioestérification)3,4,5,6,7,8,9. Alors que Uba1 est spécifique de l'activation de Ub, Uba6 présente une double spécificité pour Ub et FAT10 5,8, ce dernier étant un Ubl impliqué dans la progression mitotique10, l'immunité11,12,13,14 et impliqué dans le cancer15,16,17,18,19 ,20,21.

Alors que Uba6 a échappé à la caractérisation structurelle à ce jour, de nombreuses études ont montré que Uba1 est une grande enzyme multidomaine dans laquelle chaque domaine joue un rôle fonctionnel distinct lors de la catalyse de l'adénylation Ub22,23, E1 ~ Ub formation de liaisons thioester24,25,26, et transthioestérification E1-E2-Ub27,28,29,30. Les domaines d'adénylation actifs et inactifs (AAD et IAD, respectivement) sont responsables du recrutement initial de Ub et abritent également la machinerie catalytique pour l'adénylation de l'extrémité C-terminale de Ub dans la première étape de l'activation de Ub. Le domaine E1 Cys est arrangé en deux demi-domaines globulaires appelés les premier et deuxième demi-domaines catalytiques de cystéine (FCCH et SCCH, respectivement). Le domaine FCCH joue un rôle dans la reconnaissance de Ub et le domaine SCCH hébergeant le résidu cystéine catalytique impliqué dans la formation de la liaison thioester Ub lors de la deuxième étape de l'activation de Ub. Des études récentes ont révélé que les E1 subissent d'importants changements conformationnels nécessaires à l'adénylation et à la formation de liaisons thioester24,25,31,32. Des études d'Uba125, ainsi que de l'E1 pour l'Ubl SUMO, ont montré que l'adénylation se produit avec l'E1 dans une conformation "ouverte" et que la formation de liaisons thioester implique une rotation d'environ 130° (ou "fermeture") du domaine SCCH qui transite la cystéine catalytique dans le site actif31. Enfin, le domaine ubiquitin-fold (UFD) est impliqué dans la reconnaissance moléculaire de E2 et le transfert ultérieur de Ub de la cystéine catalytique E1 à E226,27,28,29,30. Uba6 devrait héberger une organisation de domaine similaire à Uba1 sur la base de l'analyse de séquence5. En l'absence de données structurelles, cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels Uba6 active Ub et FAT10 sont inconnus. De plus, alors que presque tout Uba1 dans les cellules de mammifères en prolifération est dans l'état Uba1 ~ Ub activé, Uba6 n'est activé qu'à 50% dans des conditions similaires6,33. La base moléculaire de cette différence reste à déterminer.

Étant donné le rôle crucial que joue la conjugaison Ub dans la régulation d'une myriade de processus cellulaires chez l'homme, il n'est peut-être pas surprenant que la machinerie enzymatique responsable de la conjugaison Ub soit elle-même soumise à plusieurs couches de mécanismes de régulation qui permettent d'affiner et de moduler sa fonction34 ,35. Les enzymes E1, E2 et E3 fonctionnant dans plusieurs voies Ub/Ubl, ainsi que les substrats Ub/Ubls eux-mêmes, sont régulés par les PTM, tels que la phosphorylation, l'acétylation, la désamidation, la ribosylation de l'ADP, l'ubiquitination, la SUMOylation et la NEDDylation34,35. En plus des PTM, plusieurs petites molécules naturelles sont connues pour réguler les voies Ub/Ubl. Par exemple, les membres de la plus grande famille de ligases E3 Ub, les cullin-RING E3 Ub ligases (CRL), sont régulés négativement par l'inositol hexakisphosphate (InsP6) et d'autres inositol phosphates36,37,38,39. Plus précisément, les CRL sont désactivées par la déneddylation médiée par le signalosome COP9 et InsP6 sert de cofacteur qui favorise l'interaction CRL/COP938,39. Il a également été révélé que InsP6 et InsP5 interagissent directement avec les sous-unités adaptatrices de substrat des CRL végétaux SCFTIR1 et SCFCOI1, jouant un rôle structurel dans le soutien de la fonction TIR1 et COI1 en tant que récepteurs d'auxine et de jasmonate, respectivement36,37. Compte tenu du rythme soutenu de découverte de PTM et des mécanismes de régulation médiés par les petites molécules de la signalisation Ub et de la rareté relative des études axées sur Uba6, les mécanismes qui régissent l'activité d'Uba6 restent inconnus.

Pour mieux comprendre la base moléculaire par laquelle Uba6 catalyse l'activation de Ub/FAT10, nous avons déterminé la structure cristalline 2,25 Å d'un complexe humain Uba6/Ub. Le complexe Uba6/Ub est observé dans deux conformations radicalement différentes : une conformation ouverte prête pour l'adénylation et un complexe fermé prêt pour la formation de liaisons thioester. De plus, nous avons observé une molécule d'inositol hexakisphosphate (InsP6) liée à une poche hautement basique conservée au cours de l'évolution, unique au domaine Uba6 SCCH. Les contacts avec InsP6 dans la conformation ouverte impliquent plusieurs résidus et éléments structuraux qui subissent un réarrangement lors de la formation de la liaison thioester et des résidus importants pour la catalyse. Nous constatons également que InsP6 inhibe allostériquement l'activité Uba6 en modifiant l'interconversion des conformations ouvertes et fermées de Uba6 tout en améliorant sa stabilité. Collectivement, nos études révèlent la base structurelle des activités catalytiques d'Uba6 et dévoilent de manière inattendue un mécanisme unique de régulation allostérique par un métabolite cellulaire naturel qui exploite les caractéristiques mécanistes spécifiques d'Uba6.

Pour élucider les mécanismes moléculaires par lesquels Uba6 active Ub/FAT10, nous avons cherché à déterminer une structure cristalline d'un complexe humain Uba6/Ub. Un mutant catalytique de la cystéine en alanine de l'Uba6 humain (C625A) capable de catalyser l'adénylation mais pas la formation de liaisons thioester (thiolation) (Fig. 1a) a été utilisé dans nos études structurelles pour réduire l'hétérogénéité de l'échantillon et faciliter la cristallisation. L'Uba6C625A humaine recombinante dérivée de cellules d'insectes a été utilisée dans nos études structurelles car les rendements en protéines étaient significativement plus élevés par rapport à l'expression dans les bactéries. Avant de mener des essais de cristallisation, l'Uba6C625A humain a été mélangé avec de l'Ub et de l'ATP·Mg2+ pour favoriser l'adénylation, et des cristaux de qualité diffraction abritant deux complexes dans l'unité asymétrique (AU) ont été obtenus. Après un criblage et un raffinement approfondis, une structure du complexe humain Uba6C625A/Ub a été déterminée à une résolution de 2,25 Å, avec des valeurs R/Rfree de 0,166/0,206 et une excellente géométrie (tableau supplémentaire 1). L'Ub des deux copies du complexe Uba6C625A/Ub humain dans l'UA présentait une densité électronique forte et continue à leurs extrémités C, compatible avec le produit Ub-adénylate. En revanche, la densité électronique correspondant au groupe partant pyrophosphate (PPi) et Mg2 + était absente (Fig. 1a supplémentaire). Ainsi, les complexes représentent le complexe produit de l'adénylation, après la libération de PPI et de Mg2+.

a Représentation schématique de la réaction de formation de thioester Uba6 ~ Ub. b Représentation en dessin animé de la structure cristalline de Uba6/Ub-AMP/InsP6 dans la conformation E1 ouverte. Le domaine IAD est en ardoise ; AAD est en rose ; FCCH est en rose vif; SCCH est en magenta ; UFD est en orange ; cys cap est en cyan; et Ub(a) est en or. La cystéine catalytique est indiquée par une sphère jaune. AMP et InsP6 sont indiqués par des sphères. c Représentation en dessin animé de la structure cristalline de hUba6/Ub-AMP dans la conformation E1 fermée présentée comme en b. Des dessins schématiques de l'organisation des domaines d'Uba6 avec des régions désordonnées indiquées par des cases hachurées sont présentés au bas de b et c.

Remarquablement, les deux copies du complexe Uba6C625A/Ub-adénylate humain dans l'UA cristallographique présentent des architectures radicalement différentes l'une par rapport à l'autre (Fig. 1b, c). En un exemplaire, le site actif d'adénylation est complètement ordonné et le domaine SCCH adopte une conformation "ouverte" où la cystéine catalytique (C625A) est à plus de 35 Å de la liaison glycyl-phosphate d'Ub-AMP qui est attaquée nucléophile lors de la liaison thioester formation (Fig. 1b). Nous nous référons ci-après à cette conformation compétente en adénylation du complexe Uba6C625A/Ub-adénylate humain comme Uba6OPEN/Ub-AMP. Dans l'autre copie du complexe dans l'UA, le site actif d'adénylation est partiellement désassemblé et le domaine SCCH adopte une conformation "fermée" présentant une rotation de corps rigide de 136° (par rapport à Uba6OPEN/Ub-AMP). Cela place le carbone β de la cystéine catalytique (C625A) ~ 4 Å de la liaison glycyl-phosphate de Ub-AMP et apporte des éléments structurels supplémentaires importants pour la formation de liaisons thioester dans le site actif (Fig. 1c). Nous nous référons ci-après à cette conformation compétente en thiolation du complexe comme Uba6CLOSED/Ub-AMP. Une comparaison plus poussée montre que l'UFD de la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP subit une rotation de corps rigide de 22° vers le domaine SCCH, par rapport à la structure Uba6OPEN/Ub-AMP (Fig. 1b, c). Ces changements structurels entraînent une réduction de la longueur du canyon entre les domaines UFD et SCCH de ~ 35 Å dans la structure Uba6OPEN / Ub-AMP à ~ 24 Å dans la structure Uba6CLOSED / Ub-AMP (Fig. 1c). Une surprise supplémentaire dans la structure Uba6OPEN / Ub-AMP était la présence d'une forte densité électronique correspondant à une molécule d'inositol hexakisphosphate (InsP6) située dans le domaine SCCH (Fig. 1b). Enfin, une région de boucle ordonnée dans le domaine SCCH qui obstrue la cystéine catalytique dans la structure Uba6OPEN/Ub-AMP (appelée "cys cap") devient désordonnée dans la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP. La façon dont les changements conformationnels observés et la liaison par InsP6 sont mécaniquement et fonctionnellement liés à l'activité Uba6 est discutée ci-dessous.

Dans l'ensemble, l'interaction Uba6/Ub est similaire à celle d'Uba1/Ub22,23 et pour mieux comprendre la double spécificité d'Uba6 pour Ub et FAT10, nous avons créé un modèle Uba6/FAT10 en ancrant FAT10 (PDB : 6GF2)40 sur Ub de la structure Uba6/Ub (Fig. 1d, e supplémentaire). Le modèle Uba6 / FAT10 et l'analyse de séquence révèlent que FAT10 n'abrite que 31% d'identité aux positions Ub qui interagissent avec Uba6 (Fig. 1f supplémentaire). Parmi les nombreuses régions de divergence entre Ub et FAT10, le patch hydrophobe Ile44 de Ub (Leu8/Ile44/Val70), qui est connu pour être crucial pour l'activation Uba1 de Ub41 et participe à un réseau similaire d'interactions hydrophobes dans Uba6/Ub structure, n'est pas conservée dans FAT10 (Fig. Supplémentaire 1d – f). Dans FAT10, la région correspondant au patch Ub Ile44 a divergé pour être beaucoup plus polaire et comprend Ser95, Thr132 et Ala159. Ainsi, le même réseau de contacts hydrophobes fonctionnellement importants auquel Ub participe avec Uba1 et Uba6 n'est pas possible pour FAT10. En plus des différences au niveau de nombreux autres résidus Ub qui interagissent avec Uba6 dans la structure Uba6/Ub, FAT10 a une insertion à deux résidus dans la boucle β1-β2 qui est à proximité de l'AAD de Uba6 où il peut participer à des interactions uniques ( Supplémentaire Fig. 1d – f) et un motif "CYCI" unique à l'extrémité C-terminale qui joue un rôle dans la spécificité42. Enfin, FAT10 diffère de Ub en ce qu'il abrite deux domaines de type Ub en tandem (NTD et CTD) reliés par une région de liaison (Fig. 1e supplémentaire) dont des études antérieures ont démontré qu'elle est cruciale pour l'activation de FAT10 par Uba640 bien qu'il soit situé assez loin de la surface de l'enzyme. Précisément comment les différences susmentionnées dans le FAT10 CTD affectent son mode de liaison à Uba6, comment le lieur NTD-CTD et éventuellement le NTD lui-même pourraient jouer un rôle dans la liaison Uba6, et si ces différences peuvent compenser l'absence du patch Ile44 hydrophobe en FAT10 attendra la détermination d'une structure Uba6/FAT10.

Le domaine SCCH est attaché aux domaines d'adénylation d'Uba6 par deux boucles flexibles. Celles-ci sont appelées la boucle croisée, qui abrite la cystéine catalytique et mène au début du domaine SCCH, et la boucle de réentrée, qui relie le domaine SCCH aux domaines d'adénylation (Fig. 2a). Comme indiqué ci-dessus, le domaine SCCH subit une rotation de 136 ° (également appelée alternance de domaine) qui fait transiter la cystéine catalytique dans le site actif d'adénylation. L'alternance du domaine SCCH s'accompagne d'une courbure de la boucle de croisement entre les résidus Arg615 à Pro623 et d'une courbure orthogonale de la boucle de réentrée entre les résidus Gly888 à Ala893 (Fig. 2a et Fig. 2b supplémentaire). Dans la structure Uba6OPEN/Ub-AMP, la cystéine catalytique est située sur une courte hélice (H18) dans la boucle de croisement, tandis que dans la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP, H18 fond dans une boucle étendue. Cela oriente la cystéine catalytique pour l'attaque nucléophile de la liaison glycyl-phosphate d'Ub-AMP (Fig. 2a et Fig. 1b supplémentaire). Le chemin altéré de la boucle de croisement, qui positionne la cystéine catalytique pour la thiolation, est stabilisé par la formation d'une courte paire de brins β (β23–β24) dans la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP, alors que les résidus comprenant β23-β24 sont boucles flexibles dans la structure Uba6OPEN/Ub-AMP (Fig. 2a).

a Comparaison du domaine Uba6 SCCH dans les conformations ouverte (adénylation active) et fermée (formation de liaison thioester active). Les domaines d'adénylation (qui servent de corps rigide d'Uba6) ont été superposés et les domaines SCCH sont représentés sous forme de dessins animés avec les cystéines catalytiques représentées sous forme de sphères. Le degré de rotation entre chaque état conformationnel du domaine SCCH est indiqué. Pour fournir un cadre de référence, la position relative de la cystéine catalytique dans les autres états conformationnels du domaine SCCH est indiquée par des cercles jaunes semi-transparents et étiquetée en conséquence dans chacun des panneaux. Des hélices sélectionnées du domaine SCCH sont marquées et leurs extrémités N- et C-terminales sont indiquées par « nt » et « ct », respectivement. b, c Les éléments des structures Uba6OPEN/Ub-AMP/InsP6 (b, Left, Middle) et Uba6CLOSED/Ub-AMP (c, Left, Middle) qui subissent des changements de conformation lors de la transition de l'adénylation à l'état compétent en thiolation sont représentés sous forme de dessins animés codés par couleur et étiquetés avec le reste du complexe représenté sous forme de représentation de surface. Vue d'ensemble des sites actifs Uba6OPEN/Ub-AMP/InsP6 (b, droite) et Uba6CLOSED/Ub-AMP (c, droite) avec des résidus qui entrent en contact avec l'intermédiaire adénylate représenté sous forme de bâtonnets. Les liaisons hydrogène sont représentées par des lignes pointillées et les molécules d'eau sélectionnées sont représentées par des sphères rouges.

En plus des changements conformationnels dans les boucles de croisement et de rentrée d'Uba6 qui accompagnent l'alternance du domaine SCCH, le capuchon cys d'Uba6 (résidus 798-817) passe d'un état ordonné dans la structure Uba6OPEN/Ub-AMP à un état désordonné dans la Uba6CLOSED /Structure Ub-AMP (Fig. 2a). Dans la structure Uba6OPEN / Ub-AMP, la coiffe cys enterre la cystéine catalytique Uba6 (Fig. 2a, b), ce qui peut la protéger des dommages oxydatifs ou chimiques qui réduiraient l'activité. Dans la structure Uba6CLOSED / Ub-AMP, l'alternance du domaine SCCH fait transiter la coiffe cys à proximité immédiate de la machinerie catalytique pour l'adénylation (Fig. 2c et Fig. 1c supplémentaire). Si la coiffe cys adoptait la même conformation que dans la structure Uba6OPEN/Ub-AMP, elle s'engagerait dans de graves affrontements stériques. Ainsi, le désordre de la coiffe cys pendant la thiolation a deux objectifs : premièrement, il augmente l'accessibilité au solvant de la cystéine catalytique, améliorant ainsi sa réactivité, et deuxièmement, il facilite l'alternance du domaine SCCH en empêchant les conflits stériques avec le domaine d'adénylation dans la conformation fermée. .

Comme indiqué ci-dessus, le site actif de la structure Uba6OPEN/Ub-AMP représente le produit Ub-adénylate de la réaction d'adénylation après la libération du groupe partant PPi et Mg2+. En ce qui concerne la liaison glycyl-phosphate entre Ub Gly76 et AMP dans l'adénylate d'Ub, l'oxygène carbonyle de Gly76 de Ub participe à un réseau de liaisons hydrogène directes et médiées par l'eau avec les azotes du squelette de Gly469, Ala470, Ile471, Gly472 d'Uba6, et le phosphate d'AMP (par exemple, l'α-phosphate d'ATP) participe à des liaisons hydrogène directes avec Ala470, Arg508 et Gln509 (Fig. 2b). L'amarrage de l'ATP·Mg2+ de la structure de S. pombe Uba1 (PDB : 4II2) dans le site actif Uba6, qui se rapproche du complexe de substrat de la réaction d'adénylation, montre que Arg46 et Arg508 sont positionnés pour interagir avec le γ-phosphate de l'ATP , Asp569 est positionné pour coordonner un ion Mg2+ conservé, et Asp499, Glu502 et Asn505 sont positionnés pour participer à la coordination d'un deuxième ion Mg2+ (Fig. 2a supplémentaire). Dans la structure Uba6CLOSED / Ub-AMP, l'oxygène carbonyle d'Ub Gly76 participe au même réseau de liaisons hydrogène directes et médiées par l'eau que celui observé dans la structure Uba6OPEN / Ub-AMP (Fig. 2c). Le phosphate AMP participe à une liaison hydrogène équivalente avec l'azote du squelette d'Uba6 Ala470 et, à la suite de l'alternance de domaine et du remodelage du site actif, a acquis une nouvelle liaison hydrogène avec Thr626 tout en perdant les contacts avec Arg508 et Gln509 (Fig. 2c). Enfin, un réseau de liaisons hydrogène médiées par l'eau a lieu entre l'azote du squelette de Gly76, les groupes AMP phosphate et adénine, et Uba6 Asp569, Asn570 et Lys628 qui est unique à la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP (Fig. 2c) .

La comparaison de la structure Uba6OPEN/Ub-AMP compétente en adénylation avec la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP compétente en thiolation révèle un vaste réseau de changements conformationnels dans le domaine d'adénylation qui sont couplés à l'alternance du domaine SCCH et servent collectivement à remodeler le site actif Uba6 pour catalyser la thiolation (Fig. 2b, c et Fig. 2c supplémentaire). Notamment, plusieurs résidus catalytiques clés émanent de régions qui subissent un remodelage lors de la transition des états compétents en adénylation à thiolation. Cela inclut les acides aminés 499 à 599 de l'AAD (appelée la "région g6" car elle abrite la courte hélice 310, g6) et l'hélice H1 (résidus 46 à 51) de l'IAD (Fig. 2c et Supplémentaire Fig. 2c) . Dans la structure Uba6OPEN/Ub-AMP, la région g6 et H1 interagissent, ce qui aide à positionner correctement les résidus clés pour l'adénylation et sert de plate-forme pour la conformation ouverte du domaine SCCH (Fig. 2b). Dans la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP compétente en thiolation, la région g6 de l'AAD se déploie et s'éloigne de l'AMP à partir de l'Ub-adénylate où elle interagit avec le domaine SCCH pour stabiliser la conformation fermée, et les hélices H1 et H2 du IAD bascule hors du site actif afin d'éviter les conflits avec le domaine SCCH (Fig. 2c et Fig. 2d supplémentaire). Cela entraîne le déplacement de résidus importants pour l'adénylation, notamment Arg46, Glu502, Asn505, Arg508 et Gln509 du site actif, et leur remplacement par des résidus importants pour la formation de liaisons thioester.

Dans la structure Uba6CLOSED / Ub-AMP, le carbone β du mutant catalytique de la cystéine C625A est à 4, 5 Å du carbone carbonyle Gly76, prêt pour l'attaque nucléophile nécessaire à la thiolation (Fig. 2a, c et Supplémentaire Fig. 2c). Lorsqu'elle est modélisée comme une cystéine, cette distance est réduite à ~ 4 Å et le soufre γ peut être placé dans la position appropriée pour la réactivité avec seulement un léger changement dans le chemin de la boucle de croisement. Thr626 participe à une liaison hydrogène avec le phosphate d'AMP et Lys628 s'engage dans un pont salin avec Asp569 du domaine d'adénylation (Fig. 2c), qui devrait coordonner Mg2 + pendant la catalyse de l'adénylation (Fig. 2a supplémentaire). Ces trois résidus (Cys625, Thr626 et Lys628) résident dans l'hélice H18 de la structure Uba6OPEN/Ub-AMP, confirmant en outre que la fusion de cette hélice dans la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP est un aspect important du remodelage du site actif qui est nécessaire au bon positionnement de ces résidus pour la thiolation.

Collectivement, nos structures fournissent les informations suivantes sur les mécanismes moléculaires par lesquels Uba6 catalyse l'adénylation et la formation de liaisons thioester. La constellation d'acides aminés dans le site actif de la structure Uba6OPEN / Ub-AMP suggère que le carboxylate C-terminal de Ub Gly76 est coordonné pour l'attaque nucléophile de l'α-phosphate de l'ATP lors de la catalyse de l'adénylation par liaison hydrogène et complémentarité de charge via des interactions avec Gly469, Ala470, Ile471, Gly472 à l'extrémité N-terminale de l'hélice Uba6 H14. Bien que l'ATP ne soit pas présent dans notre structure, la modélisation suggère que lors de la catalyse de l'adénylation, le groupe partant PPi est stabilisé par les résidus basiques et polaires Arg46, Asn505, Arg508, Gln509 et Lys521 (Fig. 2a supplémentaire). Lors de l'adénylation, en plus de stabiliser l'α-phosphate qui subit une inversion lors de l'attaque nucléophile, Mg2+ est susceptible de soulager la répulsion électrostatique entre le carboxylate d'Ub Gly76 et l'α-phosphate de l'ATP. Après la libération du groupe partant PPi, l'alternance du domaine SCCH et le remodelage du site actif désassemblent la machinerie catalytique pour l'adénylation et la réorganisent pour la thiolation. Cela entraîne la réaction vers l'avant tout en empêchant simultanément la réaction inverse (par exemple la reformation de l'ATP et de l'Ub libre). Dans les deux structures, l'α-phosphate et l'oxygène carbonyle C-terminal de Gly76 de Ub-AMP, qui sont attaqués de manière nucléophile pendant l'adénylation et la thiolation, respectivement, pointent directement vers l'extrémité N-terminale de l'hélice H14 de Uba6. À son tour, cela suggère que l'électropositivité du dipôle en hélice peut aider à stabiliser la charge négative de l'état de transition et des intermédiaires tétraédriques formés lors des réactions d'adénylation et de thiolation.

Comme indiqué ci-dessus, dans notre structure Uba6OPEN / Ub-AMP de 2, 25 Å, nous avons observé une forte densité électronique dans une poche profonde à la surface du domaine SCCH à proximité de H18 et de la cystéine catalytique Uba6 (Fig. 3a – e). Sur la base de sa symétrie sextuple et de l'environnement chimique environnant, nous avons identifié cette densité comme correspondant à une molécule d'InsP6 (Fig. 3d et Supplémentaire Fig. 3a). Étant donné que cette molécule n'était incluse ni dans la protéine ni dans les tampons de cristallisation, elle a dû être co-purifiée avec la protéine après expression dans des cellules d'insectes. La densité électronique est cohérente avec la forme la plus stable d'InsP6, myo-InsP6, dans la configuration de la chaise, le phosphate en position 2 étant axial et les phosphates en positions 1, 3, 4, 5 et 6 étant équatoriale. L'analyse de la structure montre que la molécule InsP6 se ​​lie à une poche hautement basique dans le noyau globulaire du domaine SCCH qui est presque entièrement conservée du poisson zèbre à l'homme (notez que Uba6 est spécifique aux vertébrés et aux oursins) (Fig. 3f). Le phosphate axial d'InsP6 participe à un réseau de liaisons hydrogène avec Lys644, Lys706, Lys709 et Tyr710, tandis que les phosphates équatoriaux contactent Ser647, Lys652, Lys687, Arg691 et Lys714, Trp640 jouant un rôle structurel dans l'organisation de la poche de liaison ( Fig. 3a, d).

a–c Représentations électrostatiques de surface des domaines SCCH des structures humaines Uba6 ouvertes (a), Uba6 fermées (b) et Uba1 (c). Les résidus Uba6 impliqués dans les contacts avec InsP6 dans la structure ouverte Uba6 et les résidus correspondants des structures fermées Uba6 et Uba1 sont marqués. Le capuchon cys ordonné dans la structure ouverte Uba6 est représenté par un dessin animé et un cyan coloré et les capuchons cys désordonnés de Uba6 fermé et Uba1 sont représentés par des cercles cyan en pointillés. d La carte de densité d'omission composite (contournée à 1σ) pour InsP6 dans la structure ouverte Uba6 est représentée par un maillage bleu. InsP6 est représenté sous forme de bâtons avec des carbones (vert), des oxygènes (rouge), des phosphates (orange). Les résidus interagissant avec InsP6 sont représentés par des bâtons et les liaisons hydrogène sont représentées par des lignes en pointillés. e La carte de densité d'omission composite pour la poche de liaison InsP6 dans la structure fermée Uba6 est illustrée comme dans d. InsP6 a été modélisé sur la base de la structure ouverte Uba6. f Alignement de séquence basé sur la structure de la région de liaison InsP6 dans le domaine Uba6 et Uba1 SCCH. La structure secondaire pour Uba6 est illustrée ci-dessus. Les résidus importants pour la liaison InsP6 sont mis en évidence par des étoiles jaunes. g Données de calorimétrie de titrage isotherme pour les interactions entre les variants Uba6 et Uba1 indiqués avec le phosphate d'inositol indiqué. Les expériences ont été réalisées en trois exemplaires et les panneaux supérieurs montrent des données de puissance brutes et les panneaux inférieurs montrent des ajustements des données aux équations de liaison standard à l'aide du logiciel NanoAnalyze (instruments TA). Tout au long de la figure, les étiquettes "Apo" font référence à un matériau dérivé d'E. coli.

Fait intéressant, la coiffe cys et la boucle croisée d'Uba6 abritent des résidus qui participent à un vaste réseau de contacts avec InsP6, en dehors de la poche de base sur le domaine SCCH globulaire (Fig. 3a, d). La coiffe cys recouvre la molécule InsP6 et apporte deux résidus basiques, Lys800 et Lys810, qui participent aux contacts directs et à médiation par l'eau avec trois phosphates équatoriaux d'InsP6 (Fig. 3a, d). De plus, Lys628, qui est situé à proximité de la cystéine catalytique sur l'hélice H18 dans la boucle croisée d'Uba6, contacte également deux phosphates équatoriaux d'InsP6. Notamment, le réseau de contacts entre le cys cap, la boucle de croisement et InsP6 ne peut pas avoir lieu dans la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP, car le cys cap devient désordonné et la boucle de croisement prend un chemin radicalement différent pendant l'alternance de domaine SCCH et active remodelage du site qui accompagne la thiolation (Fig. 2a, c). Conformément à cela, nous n'observons qu'une faible densité électronique correspondant aux phosphates axiaux et équatoriaux d'InsP6 dans la structure Uba6CLOSED / Ub-AMP, ainsi InsP6 n'a pas été inclus dans le modèle final (Fig. 3e). L'amarrage d'InsP6 sur le domaine SCCH de la structure Uba6CLOSED / Ub-AMP montre qu'il n'y a pas de conflits stériques majeurs avec Uba6 (Fig. 3b supplémentaire), ce qui, avec les données ci-dessus, suggère un site de liaison de faible affinité pour InsP6 dans la conformation fermée .

Alors que les résidus impliqués dans les contacts avec InsP6 dans la structure Uba6OPEN / Ub-AMP présentent une identité de 92 à 100% des oursins à l'homme, la même comparaison révèle que Uba1 ne présente que 8 à 25% d'identité avec l'Uba6 humain dans cette région avec de nombreux les différences impliquant des résidus chargés (Fig. 3f). Par conséquent, la région équivalente dans Uba1 présente des caractéristiques structurelles et une électrostatique de surface nettement différentes par rapport à Uba6 (Fig. 3c). Cela suggère que la capacité d'interagir avec InsP6 a évolué en tant que fonctionnalité spécifique à Uba6 mais pas à Uba1. Pour tester cette hypothèse, nous avons purifié Uba6 et Uba1 en utilisant E. coli et mesuré les affinités pour InsP6 en utilisant la calorimétrie de titrage isotherme (ITC). E. coli a été utilisé car cet organisme ne produit pas de phosphates d'inositol ou de phospholipides d'inositol et, par conséquent, InsP6 ne se co-purifie pas avec les protéines. Les résultats montrent que si Uba6 d'origine bactérienne se lie à InsP6 avec un KD d'environ 41 nM, Uba1 ne présente pas de liaison détectable dans les mêmes conditions (Fig. 3g). Nous avons également testé la capacité d'Uba6 à se lier aux phosphates d'inositol de signalisation InsP3 (D-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate) et InsP5 (D-myo-Inositol 1,3,4,5,6-pentakisphosphate), qui sont tous deux des précurseurs d'InsP6, et ont constaté qu'ils étaient également capables d'interagir avec Uba6, mais avec des valeurs de KD plus élevées de 248 et 73 nM, respectivement (Fig. 3g). Ceci est cohérent avec InsP3 et InsP5 dépourvus chacun du phosphate axial qui est important pour la liaison d'InsP6. Il est important de noter que la mutation des résidus Uba6 comprenant la poche de liaison InsP6 de Uba6 aux acides aminés correspondants de Uba1 (K644E/S648L/L702W/K706H/K709T/Y710Q ; ci-après dénommé Uba6_InsP6mut) annule complètement l'interaction entre Uba6 et InsP6 telle qu'évaluée en utilisant ITC (Fig. 3g et Supplémentaire Fig. 3c). Pris ensemble, ces résultats indiquent que la liaison d'InsP6 est une caractéristique spécifique à Uba6 et non à Uba1 et que la poche de liaison basique d'Uba6 est également capable de se lier à d'autres phosphates d'inositol de signalisation tels que InsP3 et InsP5. Enfin, la forte affinité d'Uba6 pour InsP6 (~ 41 nM), couplée à des concentrations intracellulaires d'InsP6 dans les cellules eucaryotes dans la gamme 10-100 μM43,44, suggère que cette liaison a une signification physiologique. Il fournit également une explication de la co-purification robuste de InsP6 avec Uba6 exprimée dans les cellules d'insectes, même après plusieurs étapes de purification.

Ensuite, nous avons examiné si InsP6 est capable de moduler l'activité d'Uba6 en déterminant les paramètres cinétiques à l'état pré-stationnaire pour la formation de liaisons thioester Uba6 ~ Ub et Uba6 ~ FAT10 en présence et en l'absence d'InsP6 50 μM. Cette concentration a été choisie car il s'agit de la concentration cellulaire médiane rapportée dans la littérature. Uba6 dérivé d'E. coli a été utilisé dans ces tests car, comme indiqué ci-dessus, E. coli ne peut pas synthétiser InsP6. Fait intéressant, nous avons constaté que si la constante de Michaelis (Km) est à peu près la même pour Ub et FAT10 en présence et en l'absence d'InsP6, la constante de vitesse observée (kobs) de la formation intermédiaire de thioester Uba6 ~ Ub et Uba6 ~ FAT10 est d'environ 3 -4 fois plus lent en présence d'InsP6 (Fig. 4a, b ; Tableau 1 ; et Figs. 4 à 6 supplémentaires). Notamment, les paramètres cinétiques pour Uba6 dérivé de cellules d'insectes sont similaires à ceux du matériau dérivé d'E. b et tableau 1).

a, b Courbes cinétiques d'Uba6 dérivé d'E. coli en présence et en l'absence d'InsP6, et d'Uba6 dérivé de cellules d'insectes, dans des tests d'activité de thioester Uba6 ~ Ubl. Tout au long de la figure, les étiquettes "Apo" font référence à un matériau dérivé d'E. coli. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SEM (n = 3 répétitions techniques). c Courbes IC50 pour l'inhibition par InsP6 des activités de formation de thioesters Ub (gauche) et FAT10 (droite) des variants Uba6 et Uba1 indiqués. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SEM (n = 3 répétitions techniques). d Effets d'InsP6 et d'autres polyphosphates d'inositol sur les activités de formation de thioester Uba6 ~ Ub (haut) et Uba6 ~ FAT10 (bas) des variants Uba6 indiqués. Les dosages ont été effectués en présence et en l'absence de 100 μM d'InsPx(3, 5 ou 6). Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SEM (n = 3 répétitions techniques) et affichées sous forme de pourcentages de la valeur WT avec des répétitions individuelles représentées par des cercles gris. e Températures de fusion des variants de domaine SCCH indiqués, déterminées par des tests de décalage thermique en présence et en l'absence de 100 μM InsPx(3, 5 ou 6). Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SEM (n = 3 répétitions techniques) avec des répétitions individuelles représentées par des cercles gris. Les données sources sous-jacentes aux Fig. 4a à e sont fournies sous forme de fichier de données source.

Pour évaluer davantage les effets d'InsP6 sur l'activité E1, des expériences dose-réponse ont été menées à l'aide d'essais de formation de thioester E1 ~ Ub et E1 ~ FAT10 utilisant Uba6_WT, Uba6_InsP6mut et Uba1_WT produits dans E. coli avec des concentrations d'InsP6 allant de 0 à 50 μM. Les résultats montrent que InsP6 inhibe Uba6 ~ Ub et Uba6 ~ FAT10 avec des valeurs IC50 de 51 et 67 nM (Fig. 4c et Supplément Fig. 7a), respectivement, conformément au KD de l'interaction Uba6 / InsP6 mesurée à l'aide de l'ITC (41 nM ). Fait important, InsP6 n'a pas réussi à inhiber l'activation d'Uba6_InsP6mut à la fois d'Ub et de FAT10, et InsP6 n'a pas réussi à inhiber l'activation d'Uba1 d'Ub (Fig. 4c). Ces résultats démontrent en outre que l'effet inhibiteur d'InsP6 est spécifique à Uba6 et est médié par la liaison à la poche basique sur son domaine SCCH. Nous avons également testé la capacité d'InsP3 et d'InsP5 à inhiber l'activation par Uba6 de Ub et FAT10 à l'aide d'essais de formation de thioester E1 ~ Ub / FAT10 (Fig. 4d et Fig. 7b supplémentaire). Ces phosphates d'inositol présentent une inhibition significativement diminuée de la formation intermédiaire de thioester Uba6 ~ Ub et Uba6 ~ FAT10 par rapport à InsP6 (Fig. 4d), ce qui était surprenant étant donné que InsP3 et InsP5 se lient à Uba6 avec une affinité élevée (valeurs KD de 248 et 73 nM , respectivement ; figure 3g). Ce résultat indique un rôle important du phosphate axial d'InsP6 dans la modulation de l'activité Uba6.

Des essais de décalage thermique ont ensuite été effectués pour déterminer si la liaison du phosphate d'inositol affecte la stabilité d'Uba6 en utilisant à la fois des variantes de domaine SCCH pleine longueur et autonomes d'Uba6 (Fig. 4e et Fig. 8 supplémentaire). Les résultats indiquent que la liaison d'InsP6 au domaine Uba6 SCCH dérivé d' E. coli augmente sa température de fusion d'environ 43 à 59 ° C, ce qui est similaire à la température de fusion de la protéine dérivée de cellules d'insectes (Fig. 4e). InsP3 et InsP5 augmentent la température de fusion du domaine Uba6 SCCH dérivé de E. coli de ~ 43 à 47 et 54 ° C, respectivement, alors qu'aucun des phosphates d'inositol n'affecte la stabilité de la protéine dérivée de cellules d'insectes (Fig. 4e). Enfin, aucun des phosphates d'inositol n'a affecté la stabilité thermique du domaine Uba6_InsP6mut SCCH dérivé d'E. coli (figure 4e), ce qui démontre à nouveau que l'activité modulatrice des phosphates d'inositol sur Uba6 est médiée par la liaison à la poche basique du domaine SCCH. . Bien que les courbes de fusion soient plus compliquées en raison de la nature multidomaine d'Uba6, les tendances décrites ci-dessus pour le domaine Uba6 SCCH sont similaires dans le contexte d'Uba6 pleine longueur (Fig. 8 supplémentaire).

L'analyse de nos structures Uba6OPEN/Ub-AMP et Uba6CLOSED/Ub-AMP donne un aperçu du mécanisme moléculaire par lequel la liaison d'InsP6 à Uba6 module son activité et sa stabilité. Comme indiqué ci-dessus, de nombreux résidus interagissant avec InsP6 dans la structure Uba6OPEN/Ub-AMP sont situés dans des régions d'Uba6 qui doivent devenir désordonnées (cys cap), adopter des conformations significativement différentes (boucle croisée et H18) ou occuper des emplacements significativement différents. en raison de l'alternance du domaine SCCH lors de la transition vers la conformation fermée pour la catalyse de la formation de liaisons thioester (Fig. 2a – c). Cela inclut Lys628 de la boucle de croisement, Lys714 du domaine SCCH et Lys800 et Lys810 de la coiffe cys, qui participent ensemble à un vaste réseau de liaisons hydrogène et de ponts salins avec les phosphates équatoriaux d'InsP6 dans la structure Uba6OPEN/Ub-AMP ( Fig. 5a, b). Dans la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP, tous ces contacts avec InsP6 sont perdus, et à la place, Lys628 et Lys714 participent à des ponts salins avec Asp569 et Glu502 au sein du site actif qui contribuent à la stabilisation de la conformation fermée (Fig. 5a, b).

a, b Les structures Uba6 ouverte (a) et Uba6 fermée (b) sont représentées sous forme de représentations de surface, à l'exception des domaines SCCH, qui sont représentés sous forme de boucles. Les éléments qui subissent des changements conformationnels dans le domaine SCCH lors de la transition de l'adénylation à l'état compétent en thiolation sont présentés sous forme de dessins animés. Les acides aminés sélectionnés sont représentés sous forme de sphères. InsP6 et AMP sont représentés sous forme de bâtonnets. La coiffe de cys désordonnée est représentée par des cercles cyan. c Domaine SCCH de la structure ouverte Uba6 modélisée en conformation fermée. SCCH ouvert (représenté sous forme de boucles) a été superposé au domaine SCCH de la structure fermée Uba6 avec Uba6 représenté comme représentation de surface. Le conflit stérique entre les éléments de SCCH [open], y compris cys cap, Helix 18, la boucle de croisement et la boucle de rentrée avec Uba6, est mis en évidence par des rectangles rouges en pointillés. d Analyse structure-fonction des chaînes latérales Uba6 représentées en a et b dans des tests de réticulation Ub-AVSN qui découplent l'adénylation et la thiolation et évaluent spécifiquement l'activité de thiolation (à gauche). Tout au long de la figure, "Apo" fait référence à un matériau dérivé d'E. coli. Schéma de Ub-AVSN et de la réticulation Uba6-Ub-AVSN (à droite). Le centre électrophile attaqué lors de la réaction avec Uba6 est indiqué par une étoile noire. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SEM (n = 3 répétitions techniques) et affichées sous forme de pourcentages de la valeur WT avec des répétitions individuelles représentées par des cercles gris. e Analyse structure-fonction des chaînes latérales Uba6 représentées en a et b dans les tests de thiolation Uba6 ~ Ub qui nécessitent à la fois une adénylation et une thiolation. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes +/- SEM (n = 3 répétitions techniques) et affichées sous forme de pourcentages de la valeur WT avec des répétitions individuelles représentées par des cercles gris. Les données source sous-jacentes aux figures 5d, e sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Cela conduit à l'hypothèse que la liaison d'InsP6 à Uba6 inhibe son activité en stabilisant la conformation ouverte de Uba6, empêchant ainsi la formation de la conformation fermée nécessaire à la thiolation. Cela se produit par la stabilisation médiée par InsP6 de la coiffe cys qui recouvre la cystéine catalytique et entrerait en conflit avec le domaine d'adénylation s'il restait ordonné dans la conformation fermée (Fig. 5c), et la stabilisation de la boucle croisée (y compris la cystéine catalytique contenant H18) dans une conformation dans laquelle la cystéine catalytique est éloignée du site actif. Conformément à cette hypothèse, nous avons constaté que l'activité modulatrice d'InsP6 est significativement diminuée chez les mutants K628A et K714D d'Uba6 dans les deux tests d'activité de formation de thioester Uba6 ~ Ub ainsi que dans les tests de réticulation Uba6-Ub-AVSN (Fig. 5d et Fig. 9a supplémentaire). , b). Ub-AVSN45,46 abrite un vinylsulfonamide électrophile conçu pour contourner la demi-réaction d'adénylation, servant ainsi spécifiquement de lecture pour la demi-réaction de thiolation en piégeant de manière covalente le nucléophile de cystéine E1 entrant. De plus, le KD de l'interaction K714D Uba6 / InsP6 a été multiplié par environ 30 (de 41 nM à 1, 45 μM) (Fig. 9c supplémentaire), conformément à la perte de liaisons hydrogène avec le phosphate 6 'et les interactions électrostatiques à longue portée. avec le 5' phosphate de InsP6. De plus, conformément à notre hypothèse, les mutants E502A et D569A présentent une activité fortement réduite à la fois dans la formation de thioesters Uba6 ~ Ub et dans les tests de réticulation Uba6-Ub-AVSN (Fig. 5d).

Dans l'ensemble, nos données suggèrent qu'InsP6 assure la médiation : (1) de la stabilisation des boucles flexibles dans le domaine SCCH (cys cap, crossover loop), (2) de la stabilisation du domaine SCCH dans la conformation ouverte, et par extension, de la rigidification de H1/H2, et des éléments structurels g6 dans le site actif, et (3) la stabilisation du domaine SCCH globulaire lui-même en reliant les deux lobes du domaine ensemble (Fig. 3a). Cela nous amène à émettre l'hypothèse que ces caractéristiques contribuent collectivement à l'augmentation significative de la stabilité thermique du complexe Uba6 / InsP6 par rapport à Uba6 seul (Fig. 4e et Fig. 8 supplémentaire). En effet, cela peut expliquer le rendement significativement plus élevé d'Uba6 recombinant lorsqu'il est exprimé dans des cellules d'insectes par rapport à l'expression dans E. coli.

Dans ce manuscrit, nous présentons des instantanés structurels d'Uba6, qui révèlent ensemble les mécanismes moléculaires par lesquels l'adénylation et la thiolation sont catalysées par cette enzyme. La structure Uba6OPEN/Ub-AMP représente le complexe produit d'adénylation après la libération de PPi/Mg2+ et la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP représente le complexe prêt pour la catalyse de la thiolation. Une comparaison des structures ouvertes et fermées révèle que l'alternance du domaine SCCH et le remodelage du site actif désassemblent le site actif d'adénylation et le reconfigurent pour la réaction de thiolation en échangeant des résidus importants pour la catalyse dans le site actif. L'hélice H14 d'Uba6 est positionnée pour constituer le trou oxyanionique du site actif en fournissant un potentiel électrostatique positif complémentaire pour la stabilisation de l'état de transition et de l'intermédiaire tétraédrique formé lors de la formation de la liaison adénylation et thioester.

Alors que de nombreuses caractéristiques mécanistes saillantes de la catalyse de l'adénylation et de la thiolation sont conservées avec d'autres E1 tels que Uba125 et l'E1 pour SUMO31, nos structures d'Uba6 révèlent une caractéristique inattendue et unique d'Uba6 ; à savoir la poche hautement basique sur le domaine SCCH qui se lie à InsP6 et qui sert à moduler à la fois l'activité et la stabilité de l'enzyme. La proximité du site de liaison InsP6 avec des éléments structurels qui jouent un rôle clé dans l'alternance du domaine SCCH et le remodelage du site actif explique comment InsP6 module l'activité Uba6. Nos données suggèrent que la réduction de l'activité de Uba6 médiée par InsP6 est due à la stabilisation des éléments structuraux qui subissent des changements de conformation lors de la transition de l'état compétent en adénylation à l'état compétent en thiolation. Fait intéressant, nos données suggèrent que ces interactions contribuent à la stabilité thermique d'Uba6 par les mêmes mécanismes. Nos résultats sont similaires à ceux d'un inhibiteur allostérique SUMO E1 appelé COH00032. Bien que son site de liaison soit totalement différent de celui d'InsP6, COH000 se lie également à une poche qui se trouve à proximité d'éléments structurels clés pour l'alternance du domaine SCCH et le remodelage du site actif et exploite ces caractéristiques mécanistes dans le cadre de son mécanisme inhibiteur32. La découverte de COH000 a conduit à la spéculation selon laquelle les enzymes E1 pourraient être régulées de manière allostérique par des métabolites cellulaires naturels, et en effet, InsP6 est le premier exemple de ce type.

Notamment, nos données démontrent que Uba6 peut également se lier à d'autres phosphates d'inositol. Ceux-ci incluent les seconds messagers InsP3 et InsP5, qui se lient avec une affinité nanomolaire, bien qu'ils n'inhibent pas l'activité d'Uba6 dans la même mesure que InsP6 (Fig. 3g). En revanche, le myo-inositol (qui manque de phosphates) ne parvient pas à se lier à Uba6 avec une affinité détectable. En principe, plus de 63 InsP phosphorylés peuvent être générés par phosphorylation séquentielle du myo-inositol, et il reste à voir comment l'incroyable complexité de la diversité des phosphates d'inositol pourrait s'interfacer avec la fonction Uba6. Par rapport à Uba6, Uba1 a une structure et une distribution de charge de surface totalement différentes dans la région correspondant au site de liaison du polyphosphate d'inositol de Uba6 et ne parvient pas à interagir de manière détectable avec les polyphosphates d'inositol (Fig. 3g). Il est intéressant de supposer que la capacité unique d'Uba6 à interagir avec les polyphosphates d'inositol pourrait sous-tendre l'observation selon laquelle seule la moitié des molécules d'Uba6 présentes à tout moment dans la cellule sont activées avec Ub/FAT10, par rapport à presque toutes les molécules d'Uba1 existant dans les polyphosphates d'inositol. état6,33. Le nombre d'enzymes impliquées dans la signalisation Ub/FAT10 dont il a été démontré qu'elles interagissent avec les phosphates d'inositol et/ou qu'elles sont régulées par eux augmente régulièrement, les premiers exemples démontrés étant la régulation InsP5 et InsP6 de la fonction culline-RING E3 Ub ligase chez les plantes et les humains36, 37,38,39. Cela suggère qu'il pourrait y avoir un sous-ensemble d'axes de signalisation Ub/FAT10 qui sont régulés par des phosphates d'inositol régissant des processus cellulaires distincts. D'un point de vue plus large, la voie Ub/FAT10 est l'une des nombreuses voies de signalisation qui sont maintenant connues pour être régulées par des interactions de haute affinité avec les seconds messagers de l'inositol phosphate et suggère que nous commençons seulement à comprendre le rôle que ces molécules jouent dans la biologie cellulaire49 ,50.

Enfin, il est intéressant de supposer que d'autres métabolites ou macromolécules cellulaires chargés négativement pourraient engager la poche de liaison basique d'Uba6 dans certains contextes cellulaires.

Par exemple, les phosphoinositides, qui abritent une variété de groupes de tête d'inositol phosphorylé, interagissent avec une variété de protéines cellulaires de manière régulée. Ces groupes de tête d'inositol phosphorylés servent de précurseurs pour les phosphates d'inositol solubles tels que InsP3, InsP4, InsP5, InsP6 dont nous avons démontré qu'ils lient Uba6 avec une haute affinité. Cela suggère qu'Uba6 pourrait être capable d'interagir avec certains phosphoinositides, qui, en plus de réguler son activité et sa stabilité, pourraient servir de mécanisme pour modifier sa localisation subcellulaire. À cet égard, il convient de noter que les rôles de Uba6 et des phosphoinositides dans l'autophagie ont été rapportés51,52. De même, cette étude renforce la possibilité que d'autres E1 puissent se lier à d'autres métabolites cellulaires naturels en tant que mécanisme de régulation. En conséquence, nous avons précédemment identifié une petite poche à la surface du domaine SCCH d'Uba1 qui devrait être un point chaud de liaison au ligand (Hotspot 3)23. La structure et l'électrostatique de Hotspot 3 dans Uba1 diffèrent du site de liaison InsP6 d'Uba6 (Fig. 3a – c) et, par conséquent, toute liaison de métabolite ou de macromolécule à cet emplacement posséderait des propriétés structurelles et physicochimiques différentes de celles des phosphates d'inositol.

Alors que nos travaux ont mis en lumière les mécanismes moléculaires par lesquels Uba6 catalyse l'adénylation et la thiolation, et ont également révélé de manière inattendue un mécanisme de régulation médié par un métabolite cellulaire, il reste encore beaucoup à apprendre sur cette enzyme. Cela comprend l'élucidation du rôle que joue la liaison du phosphate d'inositol dans la régulation de la fonction d'Uba6 dans les cellules, et si d'autres facteurs cellulaires se lient également à la poche basique sur le domaine SCCH pour moduler son activité. Des questions supplémentaires incluent la définition des règles moléculaires régissant la double spécificité d'Uba6 pour Ub et FAT10, et l'élucidation du mécanisme de transfert de ces Ub/Ubls à l'enzyme de conjugaison Uba6 apparentée à E2 Ube2Z. À cet égard, le site de liaison InsP6 d'Uba6 chevauche la surface de liaison E2 prédite de son domaine SCCH et il sera passionnant de déterminer si InsP6 joue un rôle dans la transthioestérification E1-E2-Ub. Enfin, nos structures Uba6/Ub-AMP, et en particulier les différences avec le site actif Uba1 humain, fourniront un cadre pour les efforts de découverte de médicaments ciblant spécifiquement cette enzyme pour une intervention thérapeutique dans le cancer et d'autres maladies.

Pour l'expression d'E. coli, le fragment d'ADN codant pour les résidus Uba6 humains 37 à 1052 a été cloné dans les sites NdeI/NotI du vecteur pSMT3.2 avec une étiquette SMT3 clivable par ULP1 N-terminal53. Le fragment d'ADN codant pour le domaine Uba6 SCCH humain (résidus 615–892) ou le domaine Uba1 SCCH humain (résidus 625–892) a été synthétisé (Gene Universal) et inséré dans les sites NdeI/NotI du vecteur pSMT3.4 avec un ULP1-N-terminal. étiquette SMT3 clivable. Le fragment d'ADN codant pour l'ubiquitine humaine a été inséré dans les sites NcoI/XhoI du vecteur pET29NTEV avec une étiquette 6 × His clivable par TEV N-terminal. Le fragment d'ADN codant pour la FAT10 humaine (C7T/C9T/C134L/C160S/C162S)40 a été synthétisé et inséré dans les sites BamHI/NotI du vecteur pGEX-6P1. L'ubiquitine de blé avec ses sept lysines mutées en arginine (UbK7R) a été préparée comme décrit précédemment54. Pour l'expression de cellules d'insectes, le fragment d'ADN codant pour les résidus Uba6 humains 37 à 1052 a été cloné dans les sites NcoI / NotI de pFastBac HTB avec une étiquette 6 × His clivable TEV N-terminale. La cystéine catalytique, Cys625, a été mutée en alanine pour la cristallisation. Le fragment d'ADN codant pour le domaine Uba6 SCCH humain (résidus 615–892) a été cloné dans les sites BamH / NotI de pFastBac HTB avec une étiquette 6 × His clivable TEV N-terminale. Toutes les mutations ponctuelles ont été introduites à l'aide d'une mutagenèse dirigée basée sur la PCR. Toutes les constructions et mutations ponctuelles ont été générées à l'aide des paires d'amorces décrites dans le tableau supplémentaire 2.

Toutes les protéines exprimées dans les cellules E. coli BL21 (DE3) Codon Plus (Agilent ; Cat. No. 230280) ont été produites comme décrit précédemment23. En bref, des cultures à grande échelle ont été cultivées à 37 ° C dans du milieu Luria Broth à A600 OD 2,0, puis placées dans un bain de glace pour un choc froid avec l'ajout de 1, 5% d'éthanol (v / v). Après 30 min, la protéine a été induite par l'ajout d'isopropyl-β-d-1-thioglactioside (IPTG) à une concentration finale de 0, 1 mM, suivi d'une agitation à 18 ° C pendant la nuit. Le système d'expression Bac-to-Bac Baculovirus a été utilisé pour exprimer l'Uba6 humaine dans des cellules d'insectes. Des baculovirus recombinants à titre élevé ont été utilisés pour infecter des cellules BTI-Tn-5B1–4 (Hi5) (ThermoFisher Scientific ; Cat. No. B85502) à une densité cellulaire de 2 × 106 cellules/ml cultivées dans du milieu Sf-900 II SFM (ThermoFisher Scientifique). Les cellules ont été récoltées après 48 h d'infection et stockées à -80 ° C avant une nouvelle utilisation.

Les cellules Uba6 exprimées par des cellules bactériennes ou d'insectes ont été récoltées par centrifugation et lysées par sonication dans un tampon de lyse (Tris HCl 20 mM pH 8, 0, NaCl 350 mM, Imidazole 20 mM, TCEP 0, 5 mM), en présence de DNase et Lysozyme. Le lysat cellulaire a été centrifugé à 39 191 × g pendant 30 min et le surnageant a ensuite été appliqué sur de la résine Ni-NTA (QIAGEN), et la protéine a été éluée dans un tampon Tris HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 350 mM, Imidazole 250 mM, 0,5 mM TCEP. L'étiquette SMT3 a été clivée en ajoutant la protéase ULP1 à un rapport de 1:2000 (p/p) et en incubant pendant une nuit à 4 °C. L'étiquette 6 × His a été clivée en ajoutant de la protéase TEV à un rapport de 1: 100 (p/p) et en incubant pendant une nuit à 4 ° C. Après clivage, la protéine a été soumise à une filtration sur gel Superdex 200 (GE Healthcare) avec un tampon Tris HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 350 mM, TCEP 0,5 mM, puis la protéine cible a été regroupée et soumise à une colonne échangeuse d'anions MonoQ (GE Healthcare ) avec un tampon (tampon A : Tris HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 50 mM, TCEP 0,1 mM ; tampon B : Tris HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 1000 mM, TCEP 0,1 mM) pour une purification supplémentaire. Le domaine Uba6 SCCH et le domaine Uba1 SCCH ont été purifiés comme décrit pour Uba6, à l'exception de l'utilisation d'une colonne Superdex 75 (GE Healthcare) au lieu de Superdex 200. FAT10 a été purifié par chromatographie d'affinité GST et filtration sur gel Superdex 75 (GE Healthcare). L'ubiquitine humaine et l'UbK7R de blé ont été purifiées par affinité Ni-NTA et filtration sur gel Superdex 75 (GE Healthcare). Après purification, les protéines ont été concentrées à 5-10 mg/ml, aliquotées et congelées instantanément dans de l'azote liquide.

Uba6 C625A a été purifié comme décrit ci-dessus à une concentration finale de 115 μM dans Tris HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM. Du blé UbK7R (230 μM), du MgCl2 (5 mM) et de l'ATP (1 mM) ont été ajoutés avant le criblage à matrice clairsemée dans Intelli-Plate (Art Robbins Instruments) à 18 ° C. Des cristaux de qualité diffraction du complexe Uba6 / Ub ont été cultivés en mélangeant 1 μl d'échantillon de protéine avec 1 μl de tampon de cristallisation (100 mM MES pH 6, 4, 140 mM NaF, 15% PEG3350). Les cristaux ont été congelés rapidement dans de l'azote liquide dans un cryoprotecteur composé de liqueur mère additionnée de 30 % de PEG3350.

Un ensemble complet de données de diffraction des rayons X à partir d'un seul cristal Uba6 / Ub a été collecté à une résolution de 2, 25 Å à l'Advanced Photon Source (Argonne, IL), ligne de lumière NE-CAT 22-ID-E. Toutes les données ont été indexées, intégrées et mises à l'échelle à l'aide de HKL200055. Les cristaux appartiennent au groupe d'espace C2 avec des dimensions de cellule unitaire a = 248,6 Å, b = 101,3 Å, c = 122,9 Å, et α = 90°, β = 118°, γ = 90°, avec deux complexes hUba6/Ub par asymétrie unité.

Le programme Sculptor a été utilisé pour générer un modèle d'Uba6 humain basé sur les coordonnées de H. sapiens Uba1 (PDB : 6DC6)23. Le programme PHASER56 a ensuite été utilisé pour trouver une solution de remplacement moléculaire en utilisant les coordonnées des domaines individuels (domaines AAD/IAD, FCCH, SCCH et UFD) du modèle Uba6 Sculptor et Ub du blé (PDB : 4II2). Le modèle a été affiné à des valeurs R/Rfree de 0,166/0,206 via des cycles itératifs d'affinement et de reconstruction à l'aide de PHENIX57 et COOT58. Le cycle initial de raffinement impliquait l'ajustement du corps rigide de l'AAD/IAD, du FCCH, du SCCH et de l'UFD de hUba6 et Ub. Après le cycle initial de raffinement, une densité électronique forte et continue aux extrémités C des deux molécules d'Ub dans l'UA était cohérente avec le produit Ub-adénylate, et l'AMP et la liaison glycylphosphate ont ensuite été intégrés à la densité électronique après plusieurs supplémentaires. rondes de construction et de raffinement de modèles. Dans la structure Uba6OPEN/Ub-AMP, nous avons également observé une forte densité électronique dans une poche sur le domaine SCCH que nous avons attribuée comme molécule InsP6 sur la base de la symétrie sextuple de la densité et de l'environnement chimique environnant. Nous avons placé manuellement un InsP6 dans la densité lors des derniers cycles de raffinement, qui s'est bien affiné. Dans la structure Uba6CLOSED/Ub-AMP, à l'exception de la position correspondant au phosphate axial de InsP6, la densité électronique pour InsP6 est significativement plus faible, et donc InsP6 n'a pas été modélisée.

Le modèle hUba6/Ub-AMP final contient les acides aminés 1 à 76 des deux copies de Ub (chaînes B et D), les acides aminés 40 à 1050 de la copie A de Uba6 et les acides aminés 59 à 798 et 819 à 1049 de la copie C d'Uba6. Le modèle contient deux molécules d'AMP des intermédiaires Ub-AMP des chaînes B et D, une molécule InsP6 associée à la chaîne A Uba6 et 846 molécules d'eau. Le modèle final a une bonne géométrie, avec 97,1, 2,7 et 0,2% de résidus dans les régions favorisées, autorisées et interdites de l'espace de Ramachandran, respectivement. Toutes les représentations graphiques moléculaires des structures ont été générées à l'aide de PyMOL59. Les alignements de structure ont été effectués à l'aide du programme Superpose de la suite logicielle CCP460.

Les expériences ITC ont été réalisées sur un Affinity ITC (instruments TA) à 25 ° C dans un tampon contenant 20 mM HEPES pH 7, 5, 150 mM NaCl, 0, 5 mM TCEP. Aliquots (2,5 μl chacun) de 100 μM InsP3 (D-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate sel de triammonium, Santa Cruz), InsP5 (D-myo-Inositol 1,3,4,5,6-pentakisphosphate sel de pentapotassium , Enzo) ou InsP6 (sel de sodium d'acide phytique hydraté, Sigma-Aldrich) ont été injectés dans une cellule contenant 10 μM de pleine longueur ou de domaine SCCH de protéines E1 ou Ubl. Vingt mesures ont été effectuées et les données ont été analysées à l'aide de NanoAnalyze (instruments TA). Chaque expérience a été réalisée en triple.

Des essais de formation de thioester E1 à base de gel ont été effectués avec 100 nM E1, 2,5 μM Ubl, 5 mM MgCl2, 500 μM ATP, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 5 % de glycérol et 0,1 mM TCEP à température ambiante (TA). Les réactions ont été initiées par l'ajout d'ATP et terminées par l'ajout d'un tampon SDS-PAGE d'urée non réductrice et soumises à un gel NuPAGE Bis-Tris à 4–12% (Life Technologies), 150 V constant pendant 60 min. Les gels ont été colorés avec Sypro Ruby (BioRad) et visualisés avec un ChemiDoc MP (BioRad). La quantification des données a été réalisée à l'aide de la densitométrie dans le logiciel ImageJ 1.53 et analysée à l'aide de Prism 7.0a (GraphPad). Les mesures de densitométrie ont été normalisées en pourcentage du test WT témoin sur le même gel. Les données sont représentées comme une moyenne de trois répliques techniques avec ± barres d'erreur d'écart type. Des images non traitées de gels représentatifs pour tous les tests biochimiques sont fournies dans le fichier de données source.

Tous les tests d'inhibition E1 ~ Ubl ont été effectués en incubant 100 nM de l'E1 indiqué avec 100 μM InsPx (IP3, IP5 ou IP6) dans un tampon contenant 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, et 5 mM MgCl2 pendant 5 min à température ambiante. L'ATP et l'Ubl correspondant ont ensuite été ajoutés à une concentration finale de 500 et 2,5 μM, respectivement. Les réactions ont été incubées à température ambiante pendant 2 s et terminées à l'aide d'un tampon SDS-PAGE à l'urée non réductrice. Tous les échantillons ont été soumis à SDS-PAGE, colorés, visualisés et quantifiés comme décrit ci-dessus pour les tests d'activation E1 ~ Ubl, sauf que les mesures de densitométrie ont été normalisées en pourcentage du contrôle WT sans test InsPx sur le même gel.

La réticulation des constructions de type sauvage et mutantes de E1 à Ub-AVSN a été réalisée dans un mélange réactionnel contenant 100 nM E1, 500 nM Ub-AVSN, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 5 % Glycérol et TCEP 0,5 mM à température ambiante pendant 1 min et dénaturé dans un tampon SDS-PAGE réducteur. Les échantillons ont été soumis à SDS-PAGE, colorés, visualisés et quantifiés comme décrit ci-dessus pour les tests d'activation E1 ~ Ubl.

Le marquage fluorescent d'UblCys0 avec du maléimide CF488A (Biotium) a été effectué comme recommandé par le fabricant. En bref, 50 μM UblCys0 ont été incubés avec 150 μM de colorant CF488A dans un tampon de conjugaison (20 mM HEPES pH 7, 5, 150 mM NaCl, 0, 5 mM TCEP) à température ambiante pendant une nuit. Les réactions ont ensuite été désactivées avec du DTT 5 mM et diluées pour abaisser la concentration de NaCl à 50 mM. Le mélange résultant a été soumis à une colonne EnrichS (BioRad) et élué avec un gradient linéaire (pour UbCF488A, NH4Ac 50 mM, pH 4,51, NaCl 50-1000 mM ; pour FAT10CF488A, Bis-Tris 20 mM, pH 6,5, 50-1000 NaCl mM). L'UblCF488A purifié a été regroupé et concentré.

Des réactions ont été effectuées de manière similaire à la formation de thioester E1~Ubl décrite ci-dessus, avec quelques modifications. Les réactions contenaient 100 nM E1, 0,1–10 μM UblCF488A, 5 mM MgCl2, 500 μM ATP, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 5 % glycérol et 0,1 mM TCEP pendant 2 s à la pièce température (RT). Les réactions ont été initiées par l'ajout d'ATP et terminées par l'ajout d'un tampon SDS-PAGE d'urée non réductrice et soumises à un gel NuPAGE Bis-Tris à 4–12% (Life Technologies), 150 V constant pendant 60 min. Les gels ont été imagés sur ChemiDoc MP (BioRad) avec le canal Alex488. Tous les gels ont été imagés avec une dilution en série d'une quantité connue de FAT10CF488A afin que chaque gel contienne une courbe standard pour convertir l'intensité de la bande en nanomoles de FAT10CF488A avec le logiciel ImageJ 1.53 et analysés à l'aide de Prism 7.0a (GraphPad) en ajustant les points de données dans Michaelis– Modèle de Menten. Des échantillons de chaque concentration de substrat ont été prélevés en triple exemplaire.

Les réactions contenaient 100 nM E1, 2,5 μM UblCF488A, 5 mM MgCl2, 500 μM ATP, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4, 5 % de glycérol et 0,1 mM de TCEP à différents moments (0– 20 s) à température ambiante (TA). Pour des points de temps courts (25 ms, 100 ms, 500 ms, 1 s), les réactions ont été effectuées sur un instrument de débit à trempe rapide QFM-4000. Pour initier la réaction, 20 μl d'une solution contenant E1 et ATP dans la seringue 1 ont été rapidement mélangés avec 20 μl d'une solution contenant de l'UblCF488A dans la seringue 2 à température ambiante, la réaction a ensuite été désactivée avec 20 μl de HCl 1 N/3 × non- réduisant le tampon de chargement d'urée SDS-PAGE. Pour les points de temps longs (2 s, 5 s, 10 s, 20 s), les réactions ont été effectuées manuellement. Les réactions ont été initiées en ajoutant de l'ATP et ont été terminées en ajoutant un tampon SDS-PAGE d'urée non réductrice. Les échantillons ont été soumis à SDS-PAGE, colorés, visualisés et quantifiés comme décrit ci-dessus pour estimer le Km de formation de thioester Uba6 ~ UblCF488A.

Des tests d'inhibition E1 ~ Ubl sur gel ont été effectués en incubant 100 nM de l'E1 indiqué avec 0–50 μM InsP6 dans un tampon contenant 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 pH 7,4 et 5 mM MgCl2 pendant 5 min à TA. L'ATP et l'Ubl correspondant ont ensuite été ajoutés à une concentration finale de 500 μM et 2,5 μM, respectivement. Les réactions ont été incubées à température ambiante pendant 2 s et terminées à l'aide d'un tampon SDS-PAGE à l'urée non réductrice. Les échantillons ont été soumis à SDS-PAGE, colorés et visualisés comme décrit ci-dessus pour les tests d'activation E1 ~ Ubl. La quantification des données a été effectuée à l'aide de la densitométrie dans le logiciel ImageJ 1.53 et analysée à l'aide de Prism 7.0a (GraphPad) en ajustant les points de données dans un modèle de réponse log (inhibition) à 3 paramètres. Les données sont représentées comme une moyenne de trois répliques techniques avec ± barres d'erreur d'écart type. Des images non traitées de gels représentatifs pour tous les tests biochimiques sont fournies dans le fichier de données source.

2 μg de pleine longueur ou de domaine SCCH de protéines E1 ont été mélangés avec du colorant orange SYPRO 5 × (Thermo Fisher) dans HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, TCEP 0,25 mM à 20 μl dans une plaque de réaction optique MicroAmp Fast à 96 puits ( technologies de la vie). Chaque échantillon a été préparé en triple exemplaire. Le 96 puits a été scellé avec un film adhésif optique MicroAmp (Life Technologies), puis placé dans QuantStudio 3 qRT-RCR (Applied Biosystems). La méthode de la courbe de fusion a été exécutée : la collecte continue a été sélectionnée ; 25 °C 2 min, 1,6 °C/s ; rampe de 0,05 °C/s ; 95 °C 2 min. Les données ont été enregistrées pour la construction ultérieure de courbes de fusion et la détermination de la température de fusion par Prism 7.0a (GraphPad).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les coordonnées atomiques et les facteurs de structure sont déposés dans la Protein Data Bank (PDB) avec le code d'accession 7SOL. Les données structurelles précédemment publiées utilisées à partir de l'APB sont répertoriées ci-dessous : APB : 6DC6, APB : 4II2, APB : 6GF2. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Les auteurs remercient Patrick Sung et Miklos Bekes pour la lecture critique du manuscrit. Les données de diffraction des rayons X ont été recueillies sur la ligne de lumière NE-CAT 24-ID-E à l'Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory. Ce travail est basé sur des recherches menées sur les lignes de lumière de l'équipe d'accès collaboratif du Nord-Est, qui sont financées par l'Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health (P30 GM124165). Le détecteur Eiger 16M sur 24-ID-E est financé par une subvention NIH-ORIP HEI (S10OD021527). Cette recherche a utilisé les ressources de l'Advanced Photon Source, une installation utilisateur du Bureau des sciences du Département américain de l'énergie (DOE) exploitée pour le Bureau des sciences du DOE par le Laboratoire national d'Argonne sous le contrat n° DE-AC02-06CH11357. Les recherches rapportées dans cette publication ont été soutenues par les NIH R01 GM115568, R01 GM128731 et CPRIT RR200030 (SKO). Cette recherche a utilisé les ressources des installations de base de biologie structurale, qui font partie des noyaux de recherche institutionnelle du centre des sciences de la santé de l'Université du Texas à San Antonio, soutenues par le bureau du vice-président pour la recherche et le Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174). Le détecteur Rigaku HyPix-6000HE, le goniomètre universel et l'instrumentation optique VariMax-VHF dans les installations centrales de biologie structurale sont financés par la subvention SIG S10OD030374 du NIH-ORIP. Le contenu de cette étude relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles du NIH.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Lingmin Yuan, Fei Gao.

Département de biochimie et de biologie structurale, Centre des sciences de la santé de l'Université du Texas à San Antonio, San Antonio, TX, 78229, États-Unis

Lingmin Yuan, Fei Gao, Zongyang Lv, Digant Nayak, Anindita Nayak, Priscilla Dos Santos Bury, Christine E. Cano, Lijia Jia, Elizabeth V. Wasmuth et Shaun K. Olsen

Département de recherche et développement, Beijing IPE Center for Clinical Laboratory CO, Beijing, 100176, Chine

Fei Gao

Département de biochimie et de biologie moléculaire et Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina, Charleston, SC, 29425, États-Unis

Natalia Oleinik, enseignante Firdevs Cansu Atilgan et Besim

Département de pédiatrie, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, MD, 21287, États-Unis

Katelyn M.Williams

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Université de South Alabama, Mobile, AL, 36688, États-Unis

Christophe Davies

UbiQ Bio BV, Science Park 408, 1098 XH, Amsterdam, Pays-Bas

Farid El-Oualid

Programme d'oncologie humaine et de pathogenèse, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, États-Unis

Elizabeth V. Wasmuth

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La purification des protéines a été effectuée par des sondes basées sur l'activité synthétisées, purifiées et validées par FG, LY, DN, AN et PSBFEO. Des expériences et des analyses structurelles ont été menées par FG, LY, ZL et SKOLY et FG a effectué des essais biochimiques et biophysiques. EVW, KEC, LJ, FCA, BO, KMW et CD ont participé à la conception expérimentale et à l'interprétation des données. Les figures et le manuscrit ont été préparés par LY, FG et SKO avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance avec Shaun K. Olsen.

FEO déclare des intérêts financiers concurrents en tant que co-fondateur et actionnaire d'UbiQ Bio BV. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Yuan, L., Gao, F., Lv, Z. et al. Les structures cristallines révèlent les mécanismes catalytiques et régulateurs de l'enzyme à double spécificité ubiquitine/FAT10 E1 Uba6. Nat Commun 13, 4880 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32613-5

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Reçu : 20 mars 2022

Accepté : 08 août 2022

Publié: 19 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32613-5

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