Rare amélioré

Nature volume 618, pages 87–93 (2023)Citer cet article

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Les éléments de terres rares technologiquement critiques sont notoirement difficiles à séparer, en raison de leurs différences subtiles de rayon ionique et de nombre de coordination1,2,3. La protéine naturelle de liaison aux lanthanides lanmoduline (LanM)4,5 est une alternative durable à la séparation conventionnelle basée sur l'extraction par solvant6. Ici, nous caractérisons un nouveau LanM, de Hansschlegelia quercus (Hans-LanM), avec un état oligomérique sensible au rayon ionique des terres rares, le dimère induit par le lanthane (III) étant > 100 fois plus serré que le dimère induit par le dysprosium (III) dimère. Les structures cristallines aux rayons X illustrent comment les différences de rayon à l'échelle du picomètre entre le lanthane (III) et le dysprosium (III) se propagent à la structure quaternaire de Hans-LanM par un déplacement de carboxylate qui réorganise un réseau de liaisons hydrogène de deuxième sphère. La comparaison avec le LanM prototypique de Methylorubrum extorquens révèle des stratégies de coordination des métaux distinctes, rationalisant la plus grande sélectivité de Hans-LanM au sein des éléments de terres rares. Enfin, la mutagenèse guidée par la structure d'un résidu clé à l'interface du dimère Hans-LanM module la dimérisation en solution et permet la séparation en une seule étape, sur colonne, d'un mélange néodyme(III)/dysprosium(III) à > 98 % de pureté des éléments individuels . Ce travail présente la diversité naturelle des motifs de reconnaissance sélective des lanthanides et révèle la dimérisation sensible aux terres rares comme principe biologique permettant d'ajuster les performances des processus de séparation à base de biomolécules.

Les rôles irremplaçables des éléments de terres rares (RE) dans les technologies modernes omniprésentes allant des aimants permanents aux diodes électroluminescentes et aux luminophores ont renouvelé l'intérêt pour l'un des grands défis de la science de la séparation : la séparation efficace des lanthanides1. La séparation de ces 15 éléments est compliquée par les propriétés physico-chimiques similaires de leurs ions +III prédominants, avec des rayons ioniques ne diminuant que de 0,19 Å entre LaIII et LuIII (réf. 7), ce qui conduit également à la co-occurrence de ces métaux dans RE-portant minéraux. Les méthodes d'extraction liquide-liquide hydrométallurgiques conventionnelles pour la production d'ER utilisent des solvants organiques tels que le kérosène et les extractants de phosphonates toxiques et nécessitent des dizaines, voire des centaines d'étapes pour obtenir des oxydes d'ER individuels de haute pureté3,8. L'inefficacité et l'impact environnemental important des séparations des ER9 ont stimulé les efforts de recherche sur des ligands alternatifs avec des facteurs de séparation plus importants entre les ER adjacents10,11,12,13,14 et des conceptions de processus plus écologiques pour obtenir une séparation des ER en moins d'étapes15 et en utilisant une chimie entièrement aqueuse6, 16,17,18,19,20.

La découverte du membre fondateur de la famille LanM des protéines liant les lanthanides a démontré que la nature a développé des macromolécules dépassant la sélectivité des chélateurs synthétiques des éléments f4. Le prototype LanM, de M. extorquens AM1 (Mex-LanM), est une petite protéine monomérique (12 kDa) qui subit une réponse conformationnelle sélective aux concentrations picomolaires de lanthanides4,18 et d'actinides21,22,23,24, a facilité compréhension de l'absorption des lanthanides dans les méthylotrophes25, et a servi de plate-forme technologique pour la détection des éléments f26, la récupération18,27 et la séparation6. Fait inhabituel parmi les chélateurs de RE, Mex-LanM favorise les RE légers (LRE) plus grands et plus abondants, en particulier LaIII-SmIII, par rapport aux RE lourds (HRE)4. Notre récente démonstration que même des substitutions simples aux motifs de liaison aux métaux de Mex-LanM peuvent améliorer les séparations actinide/lanthanide23 nous a incités à rechercher si les orthologues de Mex-LanM pourraient posséder des tendances de sélectivité des métaux distinctes et potentiellement utiles.

Ici, nous rapportons que le LanM de Hansschlegelia quercus (Hans-LanM), une bactérie méthylotrophique isolée à partir de bourgeons de chêne anglais28, présente une capacité de séparation RE améliorée par rapport à Mex-LanM. Alors que Mex-LanM est toujours monomérique, Hans-LanM existe dans un équilibre monomère/dimère, dont la position dépend de la liaison RE spécifique. Trois structures cristallines aux rayons X de LanMs et la mutagenèse guidée par la structure expliquent l'état oligomérique dépendant du RE de Hans-LanM et sa plus grande capacité de séparation que celle de Mex-LanM. Enfin, nous tirons parti de ces résultats pour réaliser une séparation basée sur Hans-LanM en une seule étape de la paire critique néodyme/dysprosium. Ces résultats illustrent comment les interactions intermoléculaires - courantes dans les protéines mais rares dans les petites molécules - peuvent être exploitées pour améliorer les séparations des ER.

Nous avons proposé4 plusieurs caractéristiques d'un LanM. Premièrement, les LanM possèdent quatre motifs de main EF. Les mains EF comprennent des boucles de liaison métalliques riches en carboxylates à 12 résidus flanquées d'hélices α, qui répondent traditionnellement à la liaison CaII ; 29 dans Mex-LanM, cependant, les mains EF 1 à 3 lient les ions lanthanide (III) avec des une affinité et une sélectivité de 108 fois sur CaII, résultant en une grande transition conformationnelle désordre-ordre sélectif des lanthanides4. EF4 se lie avec seulement une affinité micromolaire. Deuxièmement, les mains EF adjacentes dans les LanM sont séparées par 12 à 13 résidus - plutôt que les ≈ 25 résidus typiques des protéines de la main EF sensibles à CaII - ce qui donne une architecture inhabituelle de faisceau à trois hélices avec les sites de liaison au métal à la périphérie5. Troisièmement, au moins une main EF contient de la proline en deuxième position (dans Mex-LanM, les quatre mains EF comportent des résidus P2). Nous avons recherché des bases de données de séquences en utilisant les deux premiers critères et une longueur de séquence <200 résidus, identifiant 696 LanM putatifs. Ces séquences ont été visualisées à l'aide d'un réseau de similarité de séquences30 pour identifier les séquences LanM qui se regroupent séparément de Mex-LanM. Notamment, à un seuil d'identité de 65%, un petit cluster de séquences éloigné du cluster principal de 642 séquences est formé (Fig. 1a). Ce cluster exclusif (le cluster Hans), comprend des bactéries de plusieurs genres, dont Hansschlegelia et Xanthobacter (Extended Data Fig. 1), qui sont tous des méthylotrophes facultatifs31.

a, le réseau de similarité de séquences des séquences principales de LanM indique que Hans-LanM forme un groupe distinct. Le réseau de similarité de séquence comprend 696 séquences LanM connectées avec 48 647 arêtes, seuillées à une valeur BLAST E de 1 × 10−5 et 65 % d'identité de séquence. La boîte noire contient des nœuds groupés avec Hans-LanM. La séquence LanM associée à Mex (triangle descendant) et quatre au sein de Hansschlegelia (triangle ascendant) sont agrandies par rapport aux autres nœuds (cercles). Les couleurs des nœuds représentent la famille d'où proviennent les séquences. b, Comparaison des séquences des quatre mains EF de Mex- et Hans-LanMs. Les résidus canoniquement impliqués dans la liaison du métal dans les mains EF sont en bleu ; Les résidus Pro sont en violet. c, spectres de dichroïsme circulaire d'un titrage représentatif de Hans-LanM avec LaIII, montrant la réponse conformationnelle associée au métal augmentant l'hélicité ; l'apoprotéine est en noir gras, la protéine saturée en LaIII est en rouge gras. d, Titrage de dichroïsme circulaire de Hans-LanM avec LaIII, NdIII et DyIII (pH 5,0). Chaque point représente la moyenne ± sd de trois expériences indépendantes. e, Comparaison des valeurs Kd,app (pH 5,0) pour Mex-LanM (noir18) et Hans-LanM (rouge), tracées en fonction du rayon ionique7. Moyenne ± sem de trois expériences indépendantes.

Données source

Hans-LanM présente une identité de séquence faible (33%) avec Mex-LanM (Fig. 1 supplémentaire) et des motifs de main EF divergents, en particulier aux première, deuxième et neuvième positions (Fig. 1b), qui sont des positions importantes dans Mex- LanM23,26 et d'autres protéines EF-hand29. Par conséquent, Hans-LanM a présenté une opportunité de déterminer les caractéristiques essentielles à la reconnaissance sélective des lanthanides dans les LanMs.

Hans-LanM a été exprimé dans Escherichia coli sous la forme d'une protéine de 110 acides aminés (Fig. 1 supplémentaire). LaIII et NdIII ont été sélectionnés comme LRE représentatifs et DyIII a été sélectionné comme HRE représentatif pour les études de complexation. La protéine se lie à environ trois équivalents de LaIII et NdIII, et un peu moins de DyIII, par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (tableau supplémentaire 1), tout comme Mex-LanM4. Tout comme Mex-LanM4, Hans-LanM présente peu de contenu hélicoïdal en l'absence de métal, à en juger par le signal de dichroïsme circulaire à 222 nm (Fig. 1c). De manière inattendue, seuls deux équivalents de LaIII ou DyIII étaient suffisants pour provoquer le changement conformationnel complet de Hans-LanM (Fig. 2 supplémentaire), indiquant que le troisième équivalent de liaison est faible et n'augmente pas l'hélicité.

Les constantes de dissociation apparentes (Kd,app) déterminées par spectroscopie de dichroïsme circulaire4 reflètent les sélectivités RE versus RE, et RE versus non-RE, de Mex-LanM dans des conditions de récupération RE compétitives6,18. Par conséquent, des déterminations similaires de Kd,app avec des concentrations de métaux libres contrôlées par un chélateur compétitif4,32 ont été appliquées à Hans-LanM ; les résultats (Fig. 1d et Tableau supplémentaire 2) ont divergé de ceux de Mex-LanM. La liaison de LaIII et NdIII à Hans-LanM augmente l'ellipticité molaire à 222 nm de 2,3 fois, le changement conformationnel complet évident dans les titrages stoechiométriques. Le changement conformationnel est coopératif (coefficients de Hill, n, de 2; tableau supplémentaire 2) et les valeurs Kd, app sont similaires, respectivement 68 et 91 pM. En revanche, même si DyIII induit la même réponse globale que LaIII dans les titrages stoechiométriques (Fig. 2 supplémentaire), dans les titrages DyIII tamponnés par un chélateur, Hans-LanM présente une réponse conformationnelle moindre (augmentation de 1, 8 fois). Cette différence indique qu'au moins un des sites de liaison de DyIII est très faiblement réactif (Kd, app > 0,3 µM, la concentration la plus élevée accessible dans les titrages tamponnés avec un chélateur). La principale réponse à DyIII se produit à 2,6 nM, > 30 fois plus élevée qu'avec les LRE, et avec peu ou pas de coopérativité (n = 1,3). En revanche, Mex-LanM ne montre qu'une modeste préférence pour les LRE (environ cinq fois ; Fig. 1e ; réf. 4), et tous les lanthanides et YIII induisent des changements conformationnels et une coopérativité similaires18. Hans-LanM répond faiblement au calcium (II) (Kd, app = 60 µM), avec le même manque de coopérativité (n = 1,0) et un changement conformationnel partiel évident avec DyIII (Extended Data Fig. 2). Par conséquent, Hans-LanM discrimine plus fortement entre les LRE et les HRE que ne le fait Mex-LanM, les complexes HRE présentant une affinité plus faible, une coopérativité moindre et un changement conformationnel primaire moindre.

Les comportements distincts des complexes LRE– et HRE–Hans-LanM suggèrent un ou plusieurs mécanismes de sélectivité LRE versus HRE non présents dans Mex-LanM. Comme Mex-LanM est un monomère en complexe avec les LRE et les HRE, nous avons considéré que les LRE et les HRE pourraient induire différents états oligomériques dans Hans-LanM. En présence de trois équivalents de LaIII, Hans-LanM s'élue d'une colonne de chromatographie d'exclusion de taille (SEC) non pas au poids moléculaire attendu (MW) de 11,9 kDa mais plutôt à 27,8 kDa, suggérant un dimère (Figs. 3 supplémentaires et 4a). Commençant progressivement après NdIII mais brusquement à GdIII, le MW apparent diminue vers celui attendu pour un monomère (Fig. 2a, Fig. 4 supplémentaire et Tableau supplémentaire 3). Notamment, les lanthanides plus lourds que GdIII ne semblent pas favoriser la croissance des bactéries utilisant RE33,34,35.

a, poids moléculaire apparent des complexes Hans-LanM avec les ER tel que déterminé par SEC analytique (lignes rouges) ou SEC – MALS (ligne pointillée noire). Voir le tableau supplémentaire 1 pour les conditions. Chaque point de données individuel est le résultat d'une seule expérience. b, Le dimère Hans-LanM lié à LaIII tel que déterminé par cristallographie aux rayons X. Les ions LaIII sont représentés par des sphères vertes et les ions NaI sont représentés par des sphères grises. c, vue détaillée de l'interface dimère près de EF3 de la chaîne A (bande dessinée bleue). Arg100 de la chaîne C (dessin animé bleu clair) ancre un réseau de liaisons hydrogène impliquant Asp93 de la chaîne A et deux ligands EF3 LaIII (Glu91 et Asp85). Ces interactions constituent les seuls contacts polaires à l'interface dimère, fournissant un moyen de contrôler le rayon du site de liaison des lanthanides à EF3. d, Schéma des interactions à l'interface dimère. Les lignes pointillées rouges indiquent les interactions de liaison hydrogène et les lignes pointillées grises indiquent les contacts hydrophobes. e, projections DENSS de la densité électronique à partir d'ensembles de données de diffusion de rayons X aux petits angles pour Hans-LanM lié à LaIII (à gauche) et lié à DyIII (à droite), recouverts d'un diagramme en ruban généré par PyMOL du dimère LaIII – Hans-LanM structure en cristal.

Pour fournir un soutien supplémentaire à la dimérisation préférentielle en présence de LRE physiologiquement pertinents, les complexes RE de Hans-LanM ont été analysés à l'aide de la diffusion de la lumière multi-angle (MALS; Fig. 2a et Fig. 5 supplémentaire). Les complexes LaIII, NdIII et GdIII ont des poids moléculaires de 22 à 25 kDa, indicatifs de dimères, mais les poids moléculaires diminuent à partir de TbIII et continuent jusqu'à DyIII et HoIII, à environ 15 kDa (tableau de données étendu 1), en accord avec les données SEC. Hans-LanM lié à CaII a également indiqué un poids moléculaire de 14,7 kDa. Les complexes HRE-, CaII- et apo Hans-LanM sont encore un tiers plus grands que prévu pour un monomère, ce qui suggère que ces formes existent dans un équilibre rapide avec un rapport monomère/dimère ≈ 2: 1 dans ces conditions. Nous avons ensuite déterminé le Kd pour la dimérisation (Kdimer) de Hans-LanM lié à l'apo, à LaIII et à DyIII par calorimétrie de titrage isotherme (tableau de données étendu 2 et figures supplémentaires 6 à 8). L'apoprotéine et la protéine liée à DyIII se dimérisent faiblement, avec des valeurs de Kdimère de 117 µM et 60 µM, respectivement, compatibles avec les rapports de monomère et de dimère reflétés dans les traces SEC et MALS. En présence de LaIII, cependant, le dimère était trop serré pour pouvoir observer la monomérisation par calorimétrie de titrage isotherme, ce qui indique que Kdimer <0, 4 µM (Fig. 8 supplémentaire). Ainsi, LaIII favorise la dimérisation de Hans-LanM de > 100 fois par rapport à DyIII.

Une structure cristalline aux rayons X à résolution de 1, 8 Å de Hans-LanM en complexe avec LaIII confirme la dimérisation induite par LRE (données étendues Fig. 3 et tableau supplémentaire 4). Deux monomères LanM interagissent tête-bêche (Fig. 2b), enfouissant environ 600 Å2 de surface par des contacts hydrophobes et polaires (Fig. 2c, d). Ces interactions se produisent en grande partie entre les chaînes latérales apportées par les hélices centrales α1 (entre EF1 et EF2) et α2 (entre EF3 et EF4 ; Fig. 9 supplémentaire). Les résidus à l'interface du dimère entrent en contact direct avec un seul des quatre sites de liaison au métal, EF3 ; trois résidus d'EF3 dans chaque monomère forment un réseau de liaisons hydrogène avec Arg100 de l'autre monomère (Fig. 2c), ce qui suggère que la géométrie d'occupation et de coordination sur ce site peut contrôler l'état oligomérique.

Hans-LanM et ses complexes avec trois équivalents de LaIII, NdIII et DyIII ont également été analysés par diffusion de rayons X aux petits angles (Figs. 10 et 11 supplémentaires). Les enveloppes de solvant calculées36 à partir des données de diffusion des rayons X aux petits angles correspondent bien au dimère cristallographique Hans-LanM pour LaIII – Hans-LanM, adéquatement pour NdIII – Hans-LanM, mais mal pour DyIII – Hans-LanM (Fig. 2e et figures supplémentaires 12 à 14). La dimérisation plus faible de DyIII – Hans-LanM est également étayée par des mesures quantitatives, telles que le volume de Porod (Figs. 15 et 16 supplémentaires et Tableaux supplémentaires 5 et 6). Ensemble, les résultats biochimiques et structuraux indiquent que l'équilibre de dimérisation de Hans-LanM dépend fortement de la liaison RE particulière.

La structure de LaIII – Hans-LanM fournit également l'une des premières vues détaillées des environnements de coordination dans un LanM, et en fait de toute biomolécule naturelle chargée de la reconnaissance réversible des lanthanides. La structure RMN précédente de Mex-LanM5 a révélé le pli inhabituel de la protéine, mais elle n'a pas pu fournir de détails au niveau moléculaire sur les sites de liaison aux métaux. Pour comprendre la base de la discrimination LRE par rapport à HRE, nous avons également déterminé une structure de résolution de 1, 4 Å de DyIII – Hans-LanM. Enfin, nous rapportons une structure de résolution de 1, 01 Å de NdIII – Mex-LanM, qui rationalise la tendance de sélectivité RE moins profonde de Mex-LanM4.

Dans LaIII – Hans-LanM, EF1–3 sont occupés par des ions LaIII (données étendues Fig. 3b – e). EF4 est structurellement distinct, ne présente pas de densité de différence anormale compatible avec LaIII et a été modélisé avec NaI (Fig. 17a supplémentaire). Chaque site de liaison LaIII est à dix coordonnées, comme observé dans les structures des méthanol déshydrogénases dépendantes des lanthanides33,37 (Fig. 18 supplémentaire). Un Asn monodenté (position N1), quatre résidus Asp ou Glu bidentés (D3, D5, E9 et E12) et un squelette carbonyle (T7 ou S7) complètent la première sphère de coordination dans EF1–3 (Fig. 3a). Les ligands solvants exogènes ne sont pas observés (Fig. 17b supplémentaire); des études de luminescence de EuIII – Hans-LanM pour déterminer le nombre de molécules de solvant coordonnées ( q ) ont donné q = 0, 11, ce qui correspond à l'absence de ligands de solvant dans la structure des rayons X (Fig. 19 supplémentaire).

a, Vues agrandies de EF2 (à gauche) et EF3 (à droite) dans LaIII – Hans-LanM. Les ions LaIII sont représentés par des sphères vertes. Les liaisons de coordination et les liaisons hydrogène sont représentées par des lignes pointillées. Les résidus apportés par la chaîne A sont représentés en bleu et ceux apportés par la chaîne C (dans le cas de EF3) sont représentés en bleu clair. Encart : superposition de LaIII – Hans-LanM (bleu et bleu clair) avec DyIII – Hans-LanM (gris), montrant le déplacement du carboxylate de Glu91 de bidenté (La) à monodenté (Dy). La coordination et les liaisons hydrogène (lignes pointillées) ne sont représentées que pour le cas Dy. b, site de liaison aux métaux représentatif (EF3) dans NdIII – Mex-LanM. L'ion NdIII est représenté par une sphère aquatique. Les molécules de solvant sont représentées par des sphères rouges.

Les sites de liaison aux lanthanides dans Hans-LanM partagent en outre de vastes interactions de deuxième sphère qui peuvent encore contraindre les positions des ligands et la taille du pore de liaison au métal (Fig. 20 supplémentaire). Ce phénomène est le plus évident dans EF3, au niveau duquel l'interface dimère assure la médiation d'un réseau étendu de liaisons hydrogène impliquant plusieurs ligands. Arg100, apporté par le monomère adjacent, se projette dans le côté exposé au solvant de EF3 pour entrer en contact avec deux ligands carboxylates, Asp85 (D3) et Glu91 (E9), renforçant leurs modes de liaison bidentés. Arg100 est également renforcé par Asp93 (EF3 D11), unique à EF3 dans Hans-LanM et non observé dans Mex-LanM. Nous avons testé l'importance de ce réseau dans la dimérisation Hans-LanM en faisant la substitution minimale, R100K. Hans-LanM (R100K) avait des valeurs de Kd, app et une réponse à NdIII et DyIII presque identiques à celles de Hans-LanM de type sauvage, mais le Kd, app pour LaIII était deux fois plus faible (Fig. 21 supplémentaire et tableau supplémentaire 7). L'analyse SEC – MALS a indiqué des poids moléculaires de 10 à 13 kDa pour apo, LaIII– et DyIII – Hans-LanM (R100K) (Fig. 22 supplémentaire et Tableau supplémentaire 8), indiquant une monomérisation accrue, en particulier pour le complexe LaIII, et suggérant que une dimérisation plus faible peut être responsable de la plus faible affinité LaIII. Les quatre résidus composant le réseau Arg100 – EF3 sont complètement conservés dans le cluster Hans (Fig. 23 supplémentaire), ce qui suggère que ces interactions peuvent contribuer à la dimérisation dans ces LanM.

La structure de DyIII – Hans-LanM confirme l'importance du contrôle de la seconde sphère du positionnement du ligand (Données étendues Fig. 4, Figs supplémentaires 24 à 26 et Tableaux supplémentaires 9 et 10). La structure globale de DyIII – Hans-LanM est largement superposable à celle de LaIII – Hans-LanM, et les sphères de coordination des ions DyIII dans EF1–3 sont similaires à celles de LaIII – Hans-LanM (Fig. 3a, encadré) , à l'exception notable de E9 (par exemple, Glu91 dans EF3). Ce résidu passe de bidenté avec LaIII à monodenté avec les ions DyIII plus petits, donnant une géométrie antiprismatique carrée coiffée déformée à neuf coordonnées; le nombre de coordination inférieur avec un ion HRE est cohérent avec le cas d'autres complexes RE38,39. Dans EF3, ce déplacement du carboxylate allonge la distance entre Arg100 et l'Oε proximal de Glu91 de 2, 9 Å (dans LaIII – Hans-LanM) à 3, 2 Å (Fig. 27 supplémentaire). Le réarrangement de ce réseau de liaisons hydrogène de deuxième sphère suggère une base structurelle pour les différences dépendantes de RE dans les valeurs de Kdimère.

Les sites de liaison aux métaux de Mex-LanM diffèrent considérablement de ceux de Hans-LanM. Dans Mex-LanM, les quatre mains EF sont occupées par des ions NdIII à neuf coordonnées (EF1–3) ou à dix coordonnées (EF4), chacun comprenant deux ligands solvants, non présents dans Hans-LanM (Fig. 3b et Fig. 28). L'observation des deux molécules de solvant par site métallique et de la liaison hydrogène au résidu D9 valide des études spectroscopiques récentes21,23,26. La différence de nombre de coordination entre EF1–3 et EF4 est due au fait que le carboxylate D3 est monodenté dans EF1–3 mais bidenté dans EF4. Bien que les sites NdIII de Mex-LanM partagent les neuf et dix coordinations observées dans DyIII– et LaIII–Hans-LanM, ils ressemblent structurellement aux sites de liaison CaII à sept coordonnées de la calmoduline (Fig. 18 supplémentaire). Les nombres de coordination accrus dans Mex-LanM par rapport à la calmoduline résultent de la coordination bidentée de D5 et d'un ligand solvant supplémentaire. Ces similitudes suggèrent qu'une grande partie de la sélectivité unique de 108 fois de LanM pour les RE sur CaII résulte de différences subtiles dans la deuxième sphère de coordination et d'autres interactions plus distales. Enfin, la première sphère de coordination exclusivement dérivée de protéines dans Hans-LanM, en particulier en raison de la coordination par E9, donne des réseaux de liaisons hydrogène plus étendus (Figs. 20 et 29 supplémentaires) et améliore probablement le contrôle du rayon du site de liaison. Ainsi, les structures rationalisent l'extraordinaire sélectivité RE versus non-RE de Mex-LanM et Hans-LanM tout en tenant compte de leurs différences de sélectivité LRE versus HRE.

Les différences de stabilité et de structure entre les complexes LRE de Hans-LanM et HRE suggèrent que Hans-LanM (type sauvage et/ou R100K) surpasserait Mex-LanM dans les séparations RE/RE. Nous nous sommes concentrés sur la séparation de la paire RE de NdIII et DyIII utilisée dans les aimants permanents. Nous avons d'abord testé les stabilités des complexes RE Hans-LanM et Hans-LanM(R100K) de type sauvage contre le citrate, précédemment utilisé comme désorbant avec Mex-LanM6. Les complexes RE – Hans-LanM sont généralement moins stables contre le citrate que ceux de Mex-LanM, comme prévu sur la base d'une affinité plus faible (Fig. 1e), mais la différence de stabilité entre les NdIII – Hans-LanM et DyIII – Hans- Les complexes LanM - exprimés comme le rapport de concentration de citrate requis pour une désorption de 50% de chaque métal ([citrate] 1/2), comme indiqué par la fluorescence des deux résidus Trp de Hans-LanM (Fig. 30 supplémentaire) - est deux fois supérieur à pour les complexes Mex-LanM (Fig. 4a, Tableau supplémentaire 11 et Données étendues Fig. 5). De plus, la substitution R100K déstabilise significativement le complexe LaIII de Hans-LanM contre le citrate, alors qu'elle n'affecte que légèrement le complexe NdIII et n'affecte pas le complexe DyIII. Ce résultat confirme que la dimérisation stabilise sélectivement les complexes LRE de Hans-LanM (et en particulier le complexe LaIII), un facteur abrogé par la substitution R100K. En utilisant du malonate, un chélateur plus faible que le citrate, DyIII peut être facilement désorbé à la fois de Hans-LanM et de R100K avec un chélateur de 10 à 100 mM sans désorption NdIII significative, suggérant des conditions de séparation NdIII/DyIII (Fig. 4b).

a, Hans-LanM et la variante R100K présentent de plus grandes différences de stabilité du complexe Nd contre Dy que Mex-LanM contre la désorption par le citrate. Moyenne ± sem pour trois essais indépendants. **La différence significative entre [citrate]1/2 pour LaIII entre Hans-LanM et Hans-LanM(R100K) (protéine 20 µM) montre l'impact de la dimérisation de la stabilité du complexe LaIII (P < 0,01, analyse de variance avec Bonferroni post- test). Données Mex-LanM Nd et Dy de la réf. 6. b, Titrage spectrofluorimétrique de la variante Hans-LanM et R100K (λex = 280 nm, λem = 333 nm) à pH 5,0, illustrant la désorption induite par le malonate d'un complexe métal-protéine 2: 1. Moyenne ± sem pour trois essais indépendants, à l'exception de ceux avec R100K, qui étaient des essais uniques de chaque condition. c, Comparaison des facteurs de distribution (pH 5, 0, environ 0, 33 mM chaque RE, LaIII – DyIII) pour Hans-LanM, Hans-LanM (R100K) et Mex-LanM immobilisés. Chaque point représente la moyenne ± sd pour trois essais indépendants. d, Séparation d'un mélange 95:5 de NdIII/DyIII à l'aide de Hans-LanM(R100K) immobilisé et d'un schéma de désorption de trois concentrations étagées de malonate suivies de pH 1,5 HCl. Un volume de lit était de 0,7 ml.

Données source

Bien qu'une double modulation de la sélectivité RE par rapport au RE par dimérisation puisse sembler faible, de telles différences offrent la possibilité de réduire le nombre d'étapes de séparation, augmentant ainsi l'efficacité d'un processus de séparation3,12. Par conséquent, Hans-LanM et le variant R100K ont été immobilisés par un résidu Cys carboxy-terminal sur des billes d'agarose fonctionnalisées au maléimide, comme décrit précédemment6, et testés pour la séparation NdIII/DyIII. Hans-LanM immobilisé a lié environ un équivalent de RE, contrairement à la solution et comparé à deux équivalents pour Mex-LanM6 et Hans-LanM (R100K) (Fig. 31 supplémentaire). Hans-LanM et R100K ont présenté une capacité de séparation similaire dans la plage La – Gd - bien que R100K présente une plus grande capacité de séparation dans la plage Gd – Dy - déterminée par les rapports de distribution sur colonne (D) d'une solution RE mixte à l'équilibre (Fig. 4c, tableau de données étendu 3 et tableaux supplémentaires 12 à 14). Ces facteurs de séparation Nd/Dy sont presque le double (Hans-LanM) et le triple (Hans-LanM(R100K)) de ceux de Mex-LanM (Extended Data Table 3). Hans-LanM immobilisé a été chargé à 90% de la capacité de percée avec un mélange de déchets électroniques modèle de 5% de dysprosium et de 95% de néodyme et, guidé par la Fig. 4b, élué avec un court gradient de malonate par étapes, suivi d'une désorption complète à pH 1,5 HCl. En une seule étape de purification, Dy a été amélioré de 5% à 83% de pureté et Nd a été récupéré à 99,8% de pureté (tous deux> 98% de rendement; Extended Data Fig. 6). Cela a considérablement surpassé le procédé comparable basé sur Mex-LanM, qui n'a atteint qu'une pureté de 50 % dans une première étape de séparation et a nécessité une deuxième étape pour obtenir une pureté > 98 %6. Le variant R100K immobilisé a obtenu des résultats encore meilleurs, atteignant une séparation de base de DyIII et NdIII à une pureté > 98 % et un rendement > 99 % en une seule étape (Fig. 4d). Les meilleures performances de la variante R100K étaient inattendues et peuvent indiquer l'improbabilité de dimères fonctionnels sur la colonne à cette densité d'immobilisation (voir la légende de Extended Data Fig. 6 pour une discussion). Ainsi, malgré des performances sensiblement améliorées par rapport à Mex-LanM permises par la caractérisation du mécanisme de dimérisation de Hans-LanM, exploiter pleinement le phénomène de dimérisation sur colonne peut impliquer, par exemple, l'attache de deux monomères sur une seule chaîne polypeptidique, qui est à l'étude.

La caractérisation biochimique et structurelle du mécanisme de Hans-LanM de la dimérisation sensible aux métaux fournit un nouveau mécanisme allostérique pour la sélectivité LRE versus HRE en biologie, étendant les concepts de reconnaissance des métaux dépendants des dimères émergeant récemment des complexes de lanthanides synthétiques11 et des protéines de liaison aux métaux de transition modifiées40 et montrant que ces principes sont ancrés dans la nature. Notre travail montre également que la force de dimérisation, et donc la sélectivité des métaux, peuvent être rationnellement modulées. Hans-LanM a développé une dimérisation sélective de LRE à des concentrations de protéines physiologiques plus proches de celles de nos dosages biochimiques (10 à 20 µM) plutôt que de celles de la colonne (environ 3 mM). Par conséquent, tirer parti de la dimérisation dans un processus de séparation serait facilité en déplaçant la sensibilité de la dimérisation vers le régime de concentration plus élevé, par exemple en réglant les interactions hydrophobes à l'interface de dimérisation. De plus, nos études établissent que les LanM avec une identité aussi faible que 33 % sont facilement prédites mais présentent des différences utiles dans la sélectivité des métaux ; une exploration plus poussée de cette diversité peut révéler des mécanismes supplémentaires pour régler les séparations RE. Enfin, les sphères de coordination sans solvant de Hans-LanM devraient surpasser Mex-LanM dans la séparation RE/actinide23, la détection basée sur la luminescence21,26 et la stabilisation des ions sujets à l'hydrolyse. La poursuite de la caractérisation de la coordination et des principes supramoléculaires de la reconnaissance biologique des éléments f inspirera la conception de ligands avec des sélectivités RE versus RE plus élevées et leur mise en œuvre dans de nouveaux processus de séparation RE.

Voir les méthodes supplémentaires pour plus de détails.

La séquence de LanM de M. extorquens AM1 a été utilisée comme requête pour effectuer des recherches PSI-BLAST dans les bases de données de séquences de protéines non redondantes (nr) et de protéines métagénomiques (env_nr) du National Center for Biotechnology Information jusqu'à convergence41. Les 3 047 séquences de protéines résultantes ont ensuite été sélectionnées manuellement pour celles qui ont moins de 200 résidus de long, ont au moins une paire de mains EF séparées par moins de 14 résidus et ont 4 mains EF. Les peptides signaux des séquences LanM ont été prédits à l'aide de SignalP (v6.0)42, puis retirés avant une analyse plus approfondie des séquences.

L'outil Enzyme Function Initiative-Enzyme Similarity Tool a été utilisé pour calculer les similitudes entre toutes les paires de séquences peptidiques avec un seuil de valeur E de 1 × 10−5 (réf. 30). Le réseau de similarité de séquence résultant de 696 nœuds et 241 853 arêtes a ensuite été construit et exploré à l'aide de la disposition organique via Cytoscape (v3.9.1)43 et visualisé dans R (v4.1.0)44. Le seuil d'identité du pourcentage de bord a été progressivement augmenté de 40 % à 90 % pour produire des clusters distincts.

Les séquences LanM ont été alignées à l'aide de MUSCLE (v5.1)45 avec les paramètres par défaut. Le modèle utilisé pour la construction de la phylogénie a été sélectionné à l'aide de ModelFinder dans IQ-TREE (v2.2.0.3)46,47 avec --mset défini sur beast2. La phylogénie bayésienne a été générée sur la base de ces résultats à l'aide de BEAST (v2.6.7)48. La phylogénie résultante a été évaluée à l'aide de 107 générations et en rejetant un burn-in de 25 %, puis visualisée à l'aide de ggtree (v3.2.1)49.

Le gène codant pour Hans-LanM, codon optimisé pour l'expression dans E. coli sans son peptide signal natif à 23 résidus (voir tableau supplémentaire 15), a été obtenu auprès de Twist Bioscience et inséré dans pET-29b(+) en utilisant les sites de restriction NdeI/ Xhol. Hans-LanM a été surexprimé à l'échelle de 2 l et purifié en utilisant le protocole établi pour Mex-LanM50, avec une modification : après l'étape finale de SEC, la protéine a été concentrée à 5 ml et dialysée contre 5 g de Chelex 100 dans 500 ml de HEPES 30 mM, KCl 100 mM, 5 % de glycérol, pH 8,4, pour éliminer CaII et les contaminants métalliques traces. Cette procédure a donné environ 15 ml de protéine 550 μM, qui n'a pas été davantage concentrée. Le rendement final était de 45 mg de protéines par litre de culture. Les concentrations de protéines ont été calculées en utilisant un coefficient d'extinction de 11 000 M−1 cm−1, basé sur l'outil ExPASy ProtParam51. Hans-LanM(R100K) a été purifié en utilisant la même procédure, produisant 30 mg de protéine par litre de culture.

Les spectres de dichroïsme circulaire de Hans-LanM ont été collectés comme décrit précédemment32, à 15 µM (concentration en monomère) dans du tampon A traité au Chelex 100 (acétate 20 mM, KCl 100 mM, pH 5,0), sauf indication contraire. Des solutions métalliques tamponnées ont été préparées comme décrit précédemment4,23,25,32. Des détails supplémentaires sont disponibles dans les informations supplémentaires.

Des échantillons de Hans-LanM de type sauvage ont été préparés en ajoutant lentement 3,0 équivalents de métal (0,5 équivalent à la fois suivi d'un mélange) à 1,0 ml de stock concentré de Hans-LanM (550 μM). À ces concentrations de protéines, une légère précipitation a été observée pour les échantillons LRE (par exemple, LaIII) alors qu'une précipitation significative a été observée pour les échantillons HRE (par exemple, DyIII). Les échantillons ont été centrifugés à 12 000 g pendant 2 min pour éliminer le précipité, puis purifiés par chromatographie par filtration sur gel (HiLoad 10/300 Superdex 75 pg, boucle de 1 ml, 0,8 ml min-1) dans du tampon B (30 mM MOPS, 100 mM KCl , 5% glycérol, pH 7,0). Des pics contenant Hans-LanM (allant de 12,0 à 15,0 ml de volume d'élution) ont été collectés pour éviter les pics d'agrégats à poids moléculaire élevé, donnant 2,0 ml de Hans-LanM métallisé compris entre 114 μM et 128 μM (1,37–1,53 mg ml-1 ).

Les échantillons de Hans-LanM(R100K) ne forment pas d'espèces à poids moléculaire élevé ou ne précipitent pas lors de l'addition de métal. Pour préparer des échantillons de cette protéine, une solution de protéine de 500 μM a été diluée à 250 μM (3 mg ml-1) dans du tampon B contenant 0,75 mM d'un RECl3 spécifique, donnant une solution finale de 3 mg ml-1 de protéine, avec un 1 : 3 métal ratio, qui a été analysé directement par SEC-MALS.

Pour les conditions de calcium, les protéines ont été diluées à 250 μM (3 mg ml-1), 5 mM de CaCl2 ont été ajoutés et les échantillons ont été incubés à température ambiante pendant 1 h. Le tampon utilisé pour SEC-MALS était le même que ci-dessus, sauf qu'il contenait également 5 mM de CaCl2.

Les expériences SEC – MALS ont été menées à l'aide d'un système HPLC Agilent 1260 Infinity II équipé d'un échantillonneur automatique et d'un collecteur de fractions, et la colonne hydrophile Wyatt SEC comportait des billes de silice de 5 µm, une taille de pores de 100 Å et des dimensions de 7,8 × 300 mm. Les détecteurs d'indice de réfraction Wyatt Technology DAWN MALS et Wyatt Optilab ont été utilisés pour analyser la masse molaire des pics élués de la colonne. Le système SEC – MALS a été équilibré pendant 5 h avec le tampon B. Le système a été calibré avec de l'albumine sérique bovine (monomère MW : 66 kDa) dans le même tampon et la normalisation et l'alignement des détecteurs MALS et d'indice de réfraction ont été effectués. Un volume de 15 µl de chaque échantillon a été injecté à un débit de 0,8 ml min-1 avec un temps d'exécution du chromatogramme de 25 min. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel ASTRA (Wyatt). Lorsqu'une analyse par diffusion de rayons X aux petits angles (SAXS) était souhaitée, une deuxième analyse a été effectuée avec 150 µl de protéine (environ 4 mg ml-1) injectés, et des fractions de 200 µl du pic principal ont été collectées. Les données BioSAXS ont ensuite été recueillies en triple exemplaire.

Les constantes de dissociation pour les dimères de Hans-LanM apo, lié à LaIII et lié à DyIII ont été déterminées par des additions dilutives d'un stock de protéines concentrées, suivies d'une calorimétrie de titrage isotherme sur un calorimètre de titrage isotherme à faible volume Auto Affinity TA Instruments. La seringue contenait 300 μM de protéine (apo ou 2 équivalents de DyIII lié) ou 150 μM ou 540 μM (2 équivalents de LaIII lié), et la cellule contenait 185 μl d'un tampon adapté (30 mM MOPS, 100 mM KCl, pH 7,0 ). Les titrages ont été effectués à 30°C. Les titrages consistaient en une première injection de 0,2 µl suivie de 17 injections de 2 µl, sauf indication contraire, avec agitation à 125 tr/min et 180 s de temps d'équilibrage entre les injections. Les données ont été ajustées à l'aide de NanoAnalyze en utilisant le modèle Dimer Dissociation, donnant la constante de dissociation dimère (Kdimer), l'enthalpie de dissociation (ΔH) et l'entropie de dissociation (ΔS). Tous les paramètres sont indiqués dans le tableau de données étendu 2.

Kdimère est défini comme la constante de dissociation pour l'équilibre D \(\rightleftharpoons \) 2M, tel que Kdimère = [M]2/[D], où [D] est la concentration du dimère et [M] est la concentration du monomère, et la concentration totale de protéines [P] (mesurée à l'aide du coefficient d'extinction du monomère) est donnée par [P] = [M] + 2[D]. Donc, Kdimère = 2[M]2/([P] − [M]) ou

Cette équation peut être utilisée pour estimer les concentrations de monomères et de dimères au cours des expériences SEC-MALS, en utilisant les valeurs de Kdimère calculées à partir des expériences de calorimétrie de titrage isotherme et [P] à partir de la trace SEC-MALS. Cette équation peut également être utilisée pour estimer le Kdimère maximal possible pour la protéine liée à LaIII, compte tenu des données SEC – MALS.

Les données SAXS ont été recueillies sur Hans-LanM complexe RE, à des concentrations de protéines indiquées dans le tableau supplémentaire 5 à l'aide d'un équipement et dans les conditions décrites dans les méthodes supplémentaires.

La diffusion vers l'avant I(0) et le rayon de giration (Rg) sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 5 et ont été calculés à l'aide de l'approximation de Guinier, qui suppose qu'à de très petits angles (q < 1,3/Rg), l'intensité est approchée par I( q) = I(0)exp[−1/3(qRg)2]. Dans les conditions liées à LaIII, NdIII et DyIII, cela correspond à la taille calculée de 17,9 Å pour le dimère cristallographique. La masse moléculaire a été estimée en utilisant une comparaison avec les données SAXS d'un étalon d'albumine sérique bovine. Les fichiers de données ont été analysés pour Guinier Rg, la dimension maximale des particules (Dmax), les ajustements de Guinier, les diagrammes de Kratky et la fonction de distribution de paire-distance à l'aide du logiciel ATSAS52. GNOM, dans ATSAS, a été utilisé pour calculer la fonction de distribution paire-distance P(r), à partir de laquelle Rg et Dmax ont été déterminés. Les enveloppes de solvant ont été calculées à l'aide de DENSS36. Les profils de diffusion théoriques des modèles construits ont été calculés et adaptés aux données de diffusion expérimentales à l'aide de CRYSOL53. OLIGOMER54 a été utilisé pour estimer les fractions monomères et dimères.

A Hans-LanM (2 ml, 1,16 mM, tampon B), 3,0 équivalents de LaCl3 ou DyCl3 ont été ajoutés lentement, 0,5 équivalent à la fois avec mélange, pour minimiser la précipitation. Le précipité a été éliminé par centrifugation à 12 000 g pendant 2 min. Tous les agrégats solubles ont été éliminés et la protéine a été échangée dans un tampon dépourvu de glycérol (tampon C : 30 mM MOPS, 50 mM KCl, pH 7,0) par chromatographie de filtration sur gel (HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, boucle de 1 ml, 0,75 ml min −1). Le pic dans la plage de 70 à 85 ml a été regroupé et les fractions ont été concentrées à environ 500 μl avec une concentration finale d'environ 1,3 mM.

Mex-LanM a été purifié comme décrit précédemment50 et a été échangé dans le tampon C avant cristallisation. La protéine a été chargée avec 3,5 équivalents de NdIII (NdCl3).

Les ensembles de données de diffraction ont été collectés sur la ligne de lumière ID-G de l'équipe d'accès collaboratif des sciences de la vie et traités avec le package HKL200055. Dans toutes les structures, les informations de phase ont été obtenues avec phenix.autosol56,57 par la méthode de diffraction anormale à une seule longueur d'onde, dans laquelle les ions lanthanides identifiés avec HySS58 ont été utilisés comme diffuseurs anormaux. Les modèles initiaux ont été générés avec phenix.autobuild59 avec des cycles ultérieurs de modification manuelle et de raffinement dans Coot60 et phenix.refine61. Dans les dernières étapes de raffinement du modèle, les paramètres de déplacement anisotrope et les occupations ont été affinés pour tous les sites de lanthanides62. La validation du modèle a été réalisée avec le serveur Molprobity63. Les figures ont été préparées à l'aide du progiciel de graphisme moléculaire PyMOL (Schrödinger, LLC).

Les cristaux ont été obtenus en utilisant la méthode de diffusion de vapeur en goutte assise, dans laquelle 1 μl de solution de protéines (15 mg ml-1) a été mélangé avec 1 μl de citrate trisodique 10 mM, pH 7,0 et 27 % (p/v) PEG 6000 dans une plaque à 24 puits de Hampton Research (numéro de catalogue HR1-002) à température ambiante. De minces cristaux en forme de plaque sont apparus en 3 jours. Les cristaux adaptés à la collecte de données ont été montés sur des boucles de rayonne, trempés brièvement dans une solution cryoprotectrice constituée de la solution de puits complétée par 10% d'éthylène glycol et congelés instantanément dans du N2 liquide.

Hans-LanM chargé de LaIII cristallisé dans le groupe d'espace P21 (β = 90,024 °) avec quatre monomères dans l'unité asymétrique. Le facteur de mérite initial et le coefficient de corrélation bayésien étaient respectivement de 0,563 et 0,5664. Le modèle final comprend les résidus 24 à 133 dans chaque chaîne, 12 ions LaIII (3 par chaîne dans les première, deuxième et troisième mains EF), 4 ions NaI65 (1 par chaîne dans la quatrième main EF), 273 molécules d'eau et 2 molécules de citrate. Parmi les résidus modélisés, 100 % se trouvent dans des régions autorisées ou préférées, comme indiqué par l'analyse statistique de Ramachandran.

Les cristaux ont été obtenus en utilisant la méthode de diffusion de vapeur en goutte assise, dans laquelle 1 μl de solution de protéines (15 mg ml-1) a été mélangé avec 1 μl de citrate trisodique 250 μM, pH 7,0 et 27 % (p/v) PEG 6000 dans une plaque à 24 puits de Hampton Research à température ambiante. De minces cristaux en forme de plaque sont apparus en 1 mois. Des cristaux adaptés à la collecte de données ont été montés sur des boucles de rayonne, trempés brièvement dans une solution cryoprotectrice composée de la solution de puits complétée par de l'huile cryo perfluoropolyéther de Hampton Research (numéro de catalogue HR2-814) et congelés instantanément dans du N2 liquide.

Hans-LanM chargé de DyIII cristallisé dans le groupe d'espace P21 (β = 93,567 °) avec quatre monomères dans l'unité asymétrique. Le facteur de mérite initial et le coefficient de corrélation bayésien étaient respectivement de 0,748 et 0,5864. Le modèle final comprend les résidus 24 à 133 dans chaque chaîne (sauf pour la chaîne D, pour laquelle les résidus 34 à 38 ne peuvent pas être modélisés), 14 ions DyIII (4 dans les chaînes A et D, 3 dans les deuxième, troisième et quatrième mains EF des chaînes B et C) et 656 molécules d'eau. Parmi les résidus modélisés, 100 % se trouvent dans des régions autorisées ou préférées, comme indiqué par l'analyse statistique de Ramachandran.

La collecte d'ensembles de données anormaux est décrite dans les méthodes supplémentaires.

Les cristaux ont été obtenus en utilisant la méthode de diffusion de vapeur en goutte assise, dans laquelle 1 μl de solution de protéines (35 mg ml-1) a été mélangé avec 1 μl de sulfate d'ammonium 0,1 M, Tris 0,1 M pH 7,5 et 20 % (p/v ) PEG 1500 dans une plaque 24 puits de Hampton Research à température ambiante. De minces cristaux en forme de plaque sont apparus en 6 mois. Des cristaux adaptés à la collecte de données ont été montés sur des boucles de rayonne, trempés brièvement dans une solution cryoprotectrice constituée de la solution de puits complétée par de l'huile cryo perfluoropolyéther de Hampton Research et congelées dans du N2 liquide.

Mex-LanM chargé de NdIII cristallisé dans le groupe d'espace P212121 avec un monomère dans l'unité asymétrique. Le facteur de mérite initial et le coefficient de corrélation bayésien étaient respectivement de 0,799 et 0,5664. Le modèle final comprend les résidus 29 à 133, 4 ions NdIII et 171 molécules d'eau. Parmi les résidus modélisés, 100 % se trouvent dans des régions autorisées ou préférées, comme indiqué par l'analyse statistique de Ramachandran.

Toutes les données de fluorescence ont été recueillies à l'aide d'un fluoromètre Fluorolog-QM en configuration 75-21-C (Horiba Scientific) équipé d'un double monochromateur sur le bras d'excitation et d'un monochromateur simple sur le bras d'émission. Une lampe au xénon de 75 W a été utilisée comme source de lumière pour les mesures en régime permanent et une lampe au xénon pulsé a été utilisée pour les mesures résolues dans le temps. Des cuvettes de spectrofluorométrie en quartz de dix millimètres (Starna Cells, 18F-Q-10-GL14-S) ont été utilisées pour collecter des données à 90° par rapport au trajet d'excitation.

Les mesures de la durée de vie de la fluorescence ont été effectuées à l'aide de méthodes établies26,66. En bref, une solution de Hans-LanM avec 2 équivalents d'EuIII ajoutés, totalisant 4,5 ml, a été préparée dans une matrice 100% H2O (tampon : HEPES 25 mM, KCl 75 mM, pH 7,0). La moitié de ce mélange initial de protéines (2,25 ml) a été conservée pour une utilisation future et le reste a été remplacé par D2O par lyophilisation pour éliminer H2O et remise en suspension dans 99,9 % de D2O deux fois. Les solutions de protéines résultantes (dans 100 % de H2O et environ 99 % de D2O) ont été mélangées dans des rapports variables pour produire des teneurs en D2O de 0 %, 25 %, 50 % et 75 %. La concentration en protéines était de 20 uM. Pour chaque échantillon, la constante de temps de décroissance de la luminescence (τ) a été mesurée (λex = 394 nm, λem = 615 nm) avec 5 000 tirs sur une période de 2 500 μs. τ a été déterminé à l'aide du logiciel FelixFL Powerfit-10 (Horiba Scientific) en utilisant un seul ajustement exponentiel. 1/τ a été tracé par rapport à la composition en pourcentage de D2O, et la pente de la ligne résultante (m) a été déterminée. La valeur q a été déterminée à l'aide de l'équation suivante de la réf. 67:

où τ−1H2O et τ−1D2O sont les inverses des constantes de temps dans 100 % H2O et D2O, respectivement (cette dernière extrapolée à l'aide de l'équation de la droite d'ajustement), en ms–1 ; et nOH = 0, nNH = 0 et nO–CNH = 1 (résultant des résidus Asn à coordination métallique), sur la base des structures cristallines Hans-LanM. Cette équation se simplifie en :

Pour les expériences de compétition de fluorescence, une solution de 20 μM de Hans-LanM ou du variant R100K a été préparée dans du tampon A (pH 5,0) avec deux équivalents de métal (40 μM). Les spectres d'émission de fluorescence ont été collectés avec des paramètres : λex = 278 nm, λem 300–420 nm, temps d'intégration = 0,5 s, taille de pas = 1 nm. Les titrages ont été effectués en ajoutant au moins 0, 6 μl de titrant (à partir de solutions mères concentrées de citrate ou de malonate 10 mM – 1 M, pH 5, 0). Les spectres ont été corrigés pour la dilution. Chaque expérience a été réalisée en triple.

Hans-LanM(R100K)-Cys a été exprimé et purifié comme décrit pour Mex-LanM-Cys (réf. 6), avec un rendement final de 50 mg de protéine par litre de culture. Pour Hans-LanM-Cys, la protéine a été purifiée en incorporant les mêmes modifications ci-dessus, moins l'étape de dialyse, à notre purification Mex-LanM-Cys décrite précédemment, sauf que l'étape SEC a été exécutée à l'aide d'un tampon réducteur (30 mM MOPS , KCl 100 mM, TCEP 5 mM, pH 7,0) avec EDTA 5 mM, et congelé sous N2 liquide avant immobilisation.

La fonctionnalisation maléimide de billes d'agarose fonctionnalisées par amine a été décrite précédemment6. Voir les informations supplémentaires pour plus de détails.

L'immobilisation de Hans-LanM (R100K) a été réalisée en utilisant une réaction de conjugaison thiol-maléimide comme décrit précédemment6. Dans le cas de Hans-LanM, une concentration finale en protéines d'environ 0,4 mM (8 ml) a été combinée avec 1 ml de maléimide-microbilles et la réaction de conjugaison a été réalisée pendant 16 h à température ambiante. Hans-LanM non conjugué a été éliminé par lavage avec un tampon de couplage, et les microbilles Hans-LanM ont été stockées dans un tampon de couplage pour des tests ultérieurs. Pour quantifier le rendement d'immobilisation de Hans-LanM, Pierce BCA Protein Assay (ThermoFisher Scientific) a été utilisé pour déterminer la concentration de LanM dans la solution de réaction avant et après la réaction de conjugaison comme décrit précédemment.

Les microbilles immobilisées avec LanM ont été lavées avec de l'eau déminéralisée. Une solution d'alimentation (5 ml, RE équimolaire La – Dy, 3 mM au total, pH 5, 0) a été ajoutée à 1 ml de microbilles et incubée pendant 2 h. Le liquide à l'équilibre a été recueilli et les concentrations de RE ont été déterminées par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif en tant que [M]ad. Ensuite, 4 ml de HCl 0,1 M ont été utilisés pour désorber les RE des microbilles et les concentrations ont été mesurées par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif en tant que [M]de.

Le facteur de distribution RE (D) entre la phase LanM et la phase solution a été calculé comme suit :

dans laquelle [M]LanM et [M]Liquid sont les concentrations molaires de chaque ion métallique dans la phase LanM et la phase de solution à l'équilibre, respectivement. Pour tenir compte du liquide libre absorbé sur les microbilles d'agarose, la correction suivante a été appliquée : [M] Liquide = [M] ad ; [M]LanM = (4 × [M]de – [M]ad)/4.

Le facteur de séparation est défini comme suit :

dans laquelle DRE1 et DRE2 sont les facteurs de distribution de RE1 et RE2, respectivement.

Les colonnes ont été remplies et analysées, et les concentrations de métaux analysées, comme décrit dans nos travaux précédents6 ; les détails sont disponibles dans les méthodes supplémentaires.

Pour les expériences de séparation de paires RE, la pureté et le rendement des ions métalliques sont définis comme :

dans laquelle CRE1 et CRE2 sont les concentrations molaires de RE1 et RE2, respectivement.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données sont disponibles dans le texte principal ou dans les informations supplémentaires. Les coordonnées ont été déposées dans la Protein Data Bank avec les codes d'accession 8DQ2 (LaIII–Hans-LanM), 8FNR (DyII–Hans-LanM) et 8FNS (NdIII–Mex-LanM). Les données sources sont fournies avec ce document.

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Ce travail a été financé principalement par la subvention DE-SC0021007 du Département de l'énergie (DOE) (à JAC), ainsi que par la subvention NSF CHE-1945015 (à JAC), soutenant respectivement les travaux Hans-LanM et Mex-LanM. AKB reconnaît la subvention GM119707 des National Institutes of Health et C.-YL reconnaît une bourse du Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research. DMP, CSK-Y. et ZD reconnaissent le soutien financier du Critical Materials Institute, un pôle d'innovation énergétique financé par le DOE, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Advanced Materials and Manufacturing Technologies Office. Une partie de ce travail a été réalisée sous les auspices du DOE par le Lawrence Livermore National Laboratory sous le contrat DEAC52-07NA27344 (LLNL-JRNL-840467). Cette recherche a utilisé les ressources de l'Advanced Photon Source, une installation utilisateur du Bureau des sciences du DOE exploitée par le Laboratoire national d'Argonne sous le numéro de contrat DE-AC02-06CH11357. L'utilisation du secteur 21 de l'équipe d'accès collaboratif des sciences de la vie a été soutenue par la Michigan Economic Development Corporation et le Michigan Technology Tri-Corridor (subvention 085P1000817). NHY reconnaît les prix S10-OD0215145 des National Institutes of Health SIG pour l'instrumentation de calorimétrie à titrage isotherme, S10-OD028589 pour l'instrumentation SAXS et S10-OD030490 pour le système de diffusion dynamique de la lumière SEC-MALS. Nous remercions J. Fecko pour l'assistance expérimentale et Y. Jiao et G. Deblonde pour les discussions.

Département de chimie, Université d'État de Pennsylvanie, University Park, PA, États-Unis

Joseph A. Mattocks, Jonathan J. Jung, Chi-Yun Lin, Emily R. Featherston, Timothy A. Hamilton, Amie K. Boal et Joseph A. Cotruvo Jr

Critical Materials Institute, Direction des sciences physiques et de la vie, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, Californie, États-Unis

Ziye Dong, Christina S. Kang-Yun et Dan M. Park

The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University, University Park, PA, États-Unis

Neela H. Yennawar

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Université d'État de Pennsylvanie, University Park, PA, États-Unis

Amie K. Boal

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JAC a identifié Hans-LanM et a conçu et dirigé l'étude. JAM a purifié Hans-LanM et effectué la plupart des analyses biochimiques, avec l'aide de TAHJJJ, a cristallisé les protéines, et JJJ et C.-YL ont résolu les structures avec la contribution d'AKBNHY, ont réalisé des études SAXS et supervisé une collecte de données biophysiques. ERF purifié Mex-LanM. CSK-Y. ont effectué des analyses bioinformatiques. ZD a réalisé des expériences de séparation des métaux, avec la contribution de DMPJAM, NHY, AKB et JAC, a rédigé l'article avec la contribution de tous les auteurs. Tous les auteurs ont édité et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Dan M. Park, Amie K. Boal ou Joseph A. Cotruvo Jr.

JAM, JJJ, C.-YL, ZD, ERF, CSK-Y., DMP, AKB et JAC sont les inventeurs d'une demande de brevet déposée par la Pennsylvania State University sur la base de ces travaux.

Nature remercie Scott Banta et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Le cluster Hans comprend des LanM de bactéries des genres Hansschlegelia, Ancylobacter, Methylopila, Oharaeibacter, Starkeya et Xanthobacter. Bien que ces genres soient limités à ce groupe, les membres au niveau de la famille se trouvent dispersés dans tout le réseau, y compris une Xanthobacteraceae et 42 Methylocystaceae.

DyIII (jusqu'à 0,3 µM) et CaII (jusqu'à 5,5 mM) induisent un changement conformationnel similaire et incomplet dans la protéine, par rapport au changement conformationnel induit par NdIII et LaIII. Les données dans le panneau de droite de a sont un titrage représentatif des 3 ensembles de données utilisés pour générer le tracé dans le panneau de gauche. Les données en b et c sont des titrages représentatifs des 3 ensembles de données utilisés pour générer le tracé de la Fig. 1d. Conditions : protéine 15 μM, acétate 20 mM, KCl 100 mM, EDTA 10 mM (pour les titrages Ca et Nd) ou EGTA (pour le titrage Dy), ion métallique 0-10 mM. Chaque point de données dans (a, panneau de gauche) est la moyenne ± sd pour trois mesures indépendantes.

Données source

a, Structure globale de l'unité asymétrique, constituée de deux dimères Hans-LanM et de deux molécules de citrate issues de la solution de cristallisation. La structure de chaque monomère du dimère est cohérente avec la structure de la solution RMN de Mex-LanM lié à YIII avec les mains EF 2 et 3 appariées et les mains EF 1 et 4 appariées5. b–e, Détails de la coordination des métaux dans les quatre mains EF de LaIII-Hans-LanM. Les sphères de coordination des ions LaIII dans les mains EF 1, 2 et 3 sont constituées par la chaîne latérale Oδ de N1 (monodentate), les chaînes latérales carboxylate de D3, D5, E9 et E12 (toutes bidentées) et un squelette carbonyle de S7 (EF1) ou T7 (EF2 et EF3), pour un nombre total de coordination de 10. Toutes les distances LaIII-ligand sont de 2,5 à 2,7 Å. Le rayon cristallin pour LaIII à 10 coordonnées est donné à 1,41 Å par Shannon ; 7 étant donné 1,26 Å comme rayon de 6 coordonnées O2-, 2,57 Å est estimé pour la distance LaIII-O, conformément à nos résultats. L'ion métallique dans EF4 a été modélisé comme NaI en raison des distances métal-ligand plus courtes, du nombre de coordination inférieur et de la présence de sodium dans la solution de cristallisation. CaII ne peut pas être complètement exclu car il était présent plus tôt dans la purification de la protéine ; cependant, la protéine a été traitée avec Chelex à la fin de la purification, et les données cristallographiques étaient cohérentes avec l'attribution de NaI telle que déterminée par le serveur CheckMyMetal65. Cet ion est coordonné dans une géométrie bipyramidale pentagonale déformée par les chaînes latérales monodentées D1, N3 et D5, la chaîne latérale bidentée E12, le squelette carbonyle de Lys113 et une seule molécule de solvant pour un nombre total de coordination de 7. Les distances NaI-ligand protéique sont 2,3-2,5 Å, avec une molécule de solvant à 2,7 Å. Dans le cas de Mex-LanM, les données biochimiques4,26 et la spectroscopie RMN5 ont également soutenu EF4 en tant que site de liaison aux lanthanides médiocre, et il a été modélisé sans ion métallique dans la structure à l'état de solution RMN5.

a, l'un des dimères de l'unité asymétrique, comprenant les chaînes A et B. Notez que EF4 est occupé de manière inattendue par DyIII tandis que EF1 n'est occupé que dans la chaîne A. b, structure globale de l'unité asymétrique, qui se compose de deux Hans-LanM dimères. Contrairement à la structure LaIII-Hans-LanM, les deux dimères - et les monomères au sein de chaque dimère - présentent des différences significatives dans DyIII-Hans-LanM. EF2-4 sont occupés par DyIII dans toutes les chaînes, alors que EF1 n'est occupé et ordonné que dans la chaîne A ; dans les chaînes B et C, aucun ion métallique n'est lié dans la main EF, et dans la chaîne D, un ion DyIII est lié mais les cinq premiers résidus de EF1 (Asn34 - Asp38) n'ont pas pu être modélisés. Notre décision de modéliser DyIII dans les quatre mains EF est étayée par des ensembles de données de diffraction anormaux (tableaux supplémentaires 9 à 10, figures supplémentaires 25 à 26). Les données biochimiques suggèrent qu'en solution, au moins un site de liaison DyIII est faible (voir Fig. 1d et Fig. 2 supplémentaire), et il est probablement basé sur des études de Mex-LanM que EF2/3 sont les sites de liaison les plus étroits. Cette proposition est étayée par les données anormales de Dy (tableau supplémentaire 10), et l'occupation de sites de liaison aux métaux faibles résulte probablement de la concentration élevée de protéines utilisée pour la cristallographie. c, Détails de la coordination du métal dans les mains EF de DyIII-Hans-LanM. Dans la rangée du haut, les trois structures EF1 différentes dans l'unité asymétrique sont affichées. Ce n'est que dans la chaîne A que le site métallique EF1 est presque identique aux sites de EF2 et EF3 (contrairement à LaIII-Hans-LanM, où les sites EF1-3 sont très similaires, Extended Data Fig. 3). Dans EF1 (chaîne A), EF2 et EF3, les ligands de coordination sont les mêmes qu'avec LaIII-Hans-LanM, sauf que les résidus E9 (Glu42, Glu66 et Glu91) sont passés à une coordination monodentate, ce qui entraîne une coordination 9 . Le nombre de coordination inférieur avec DyIII est cohérent avec la contraction des lanthanides68,69 et est observé avec d'autres ligands (comme un exemple récent, réf. 39). Les distances DyIII-ligand sont généralement de 2,3 à 2,5 Å, ~ 0,2 Å plus courtes que pour LaIII-Hans-LanM. Conformément à cette observation, le rayon cristallin pour DyIII à 9 coordonnées est donné à 1, 22 Å par Shannon7, soit 0, 19 Å plus court que pour LaIII à 10 coordonnées (données étendues Fig. 3). Le déplacement carboxylate du résidu Glu en 9ème position est remarquable car cette position est importante pour l'affinité et la sélectivité de déclenchement dans d'autres protéines de la main EF70. Dans EF4, DyIII est en 7 coordonnées avec une géométrie bipyramidale pentagonale, similaire au site sodium dans LaIII-Hans, mais avec des distances métal-ligand légèrement plus courtes (2,2-2,5 Å); encore une fois, ces distances sont conformes à l'attente pour DyIII à 7 coordonnées (réf. 7).

Les valeurs d'émission sont normalisées à 1,0 pour la fluorescence de l'apoprotéine. Notez que l'intensité de fluorescence des résidus Trp de Hans-LanM diminue en passant de l'état lié au RE à l'état apo (Fig. 30 supplémentaire), tandis que l'intensité du résidu Tyr de Mex augmente en passant de l'état lié au RE à l'état apo4,6. Conditions initiales : protéine 20 μM, ER 40 μM, acétate 20 mM, KCl 100 mM, pH 5,0, pour toutes les expériences, dans lesquelles des concentrations croissantes de citrate ont été titrées. Les concentrations de citrate auxquelles 50 % de chaque métal sont désorbés dans ces conditions ([citrate] 1/2) sont résumées dans le tableau supplémentaire 11 et tracées sur la figure 4a. a, Hans-LanM. b, Hans-LanM(R100K). La différence compressée entre les valeurs de [citrate] 1/2 pour La et Nd dans Hans-LanM(R100K) par rapport à Hans-LanM de type sauvage illustre le rôle de la dimérisation dans l'amélioration des différences d'affinité pour les LRE, en particulier LaIII. c, Mex-LanM. Les données Nd et Dy ont été rapportées dans Dong et al6. d, Comparaison des rapports de la valeur [citrate]1/2 pour Nd à celle de Dy, pour chaque protéine, illustrant la plus grande sélectivité Nd/Dy de Hans-LanM par rapport à Mex-LanM. Les rapports pour Hans-LanM de type sauvage et la variante R100K ne sont pas significativement différents (p > 0,05) par test t bilatéral, ce qui suggère que le réseau de liaisons hydrogène impliquant Arg100 contribue relativement peu à la sélectivité NdIII/HRE, bien qu'il a un impact significatif sur la sélectivité LaIII (Fig. 4a). Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd (a—c) ou sem (d) pour les données de 3 expériences indépendantes.

Données source

Le schéma de désorption consistait en trois concentrations étagées de malonate (30, 50, 90 mM; voir axe de droite) suivies de pH 1,5 HCl. Les résultats ont révélé qu'une pureté Dy légèrement inférieure était générée à l'aide de Hans-LanM par rapport à la variante R100K (83, 6% contre 98% de pureté Dy à un rendement similaire, respectivement; comparer à la figure 4d). Alors que des profils de sélectivité similaires ont été observés pour les protéines immobilisées pour La à Gd dans des expériences de liaison à l'équilibre avec La-Dy, le schéma de sélectivité a divergé à Tb (Fig. 4c). La différence de sélectivité entre Hans-LanM et la variante R100K a été confirmée en utilisant un système binaire Nd/Dy, car les incertitudes dans la détermination du facteur de distribution pour Dy dans le groupe RE à 9 éléments ont empêché la capacité de distinguer de petites différences dans le Dy/ Facteur de séparation Nd entre les protéines (tableaux supplémentaires S13–S14). Dans cette expérience binaire Nd/Dy (tableau de données étendu 3), nous avons déterminé un facteur de séparation de 8,12 ± 0,40 pour Hans-LanM et de 12,7 ± 1,3 pour la variante R100K, ce qui est cohérent avec l'amélioration de l'efficacité de séparation Dy de R100K. Bien que cohérents avec les valeurs dérivées de l'expérience à 9 éléments, les résultats diffèrent légèrement des résultats de liaison à l'équilibre avec les protéines libres Hans-LanM et Hans-LanM (R100K), qui ont révélé une sélectivité également élevée pour Nd par rapport à Dy (Fig. 4a ,b), reflétant probablement une dimérisation induite par LRE plus faible dans la variante R100K à la faible concentration en protéines (20 µM) des expériences en solution avec des protéines libres. La sélectivité La/Nd sur colonne est également distincte de celle observée avec les valeurs apparentes de Kd des protéines libres (de type sauvage et R100K) en solution, bien que les expériences avec des protéines libres aient utilisé des solutions à un seul élément et que les effets de la liaison de métaux mixtes puissent impact sur les données de la colonne. La variante R100K se comporte également mieux sur la colonne, comme en témoigne la stoechiométrie 2:1 RE:protéine. Une explication possible de ces résultats pourrait être que l'immobilisation interfère avec la dimérisation ; cependant, la figure 2b montre les extrémités N et C du dimère Hans-LanM, indiquant que les extrémités C sont à environ 20 Å de la partie la plus proche de l'interface du dimère, ce qui suggère que l'immobilisation en soi ne devrait pas perturber cette interface. Il faut cependant considérer qu'un dimère fonctionnel nécessiterait que deux extrémités C-terminales soient immobilisées à proximité, ce qui est peu probable aux densités d'immobilisation de nos colonnes. Par conséquent, tout compte fait, nous soupçonnons que l'équilibre de dimérisation n'est applicable que dans une minorité d'unités protéiques immobilisées sur la colonne. Nous postulons que l'exploitation plus complète de l'équilibre de dimérisation dans le format de colonne donnerait des séparations encore plus robustes. Le moyen le plus sûr d'obtenir des populations homogènes de dimères sur colonne serait probablement de lier deux monomères ensemble (par exemple, avec une chaîne polypeptidique), d'ajuster l'affinité de dimérisation par mutagenèse des résidus contribuant aux interactions inter-monomère et d'immobiliser ce dimère par un point d'attache unique. La dimérisation pourrait également être exploitée dans d'autres formats de séparation. Ces orientations font l'objet d'efforts en cours.

Données source

Ce fichier contient des méthodes supplémentaires, des figures supplémentaires 1 à 31, des tableaux supplémentaires 1 à 16 et des références supplémentaires.

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Réimpressions et autorisations

Mattocks, JA, Jung, JJ, Lin, CY. et coll. Séparation améliorée des terres rares avec un dimère de lanmoduline sensible aux métaux. Nature 618, 87–93 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05945-5

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Reçu : 29 décembre 2022

Accepté : 13 mars 2023

Publié: 31 mai 2023

Date d'émission : 01 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-05945-5

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